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影响毕赤酵母高效表达重组蛋白的主要因素有哪些?

毕赤酵母(Pichia pastoris) 是单细胞真核生物,它既具有原核生物易于培养、繁殖快和便于基因工程操作等特性, 同时又具有真核生物对基因产物正确折叠及翻译后加工及修饰能力, 所以毕赤酵母常用于表达外源蛋白。影响毕赤酵母高效表达重组蛋白的因素很多,本文主要从分子水平上对影响因素进行总结分析,其中包括基因拷贝数、密码子偏爱性、启动子、分子伴侣、信号肽和糖基化修饰等因素, 并对发酵工艺进行概述。1 基因拷贝数基因拷贝数是毕赤酵母表达重组蛋白的一个影响因素。在一定范围内增加毕赤酵母中外源基因的...

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重组蛋白表达系统小结

重组蛋白表达技术是研究蛋白质功能、结构,以及筛选靶向药物的有力工具,在基础科学以及医药学领域发挥了重要作用。目前常用的表达系统有以下几类:1 原核表达系统1.1大肠杆菌( Escherichia coli) - 典型的T7 表达系统基于T7 RNA 聚合酶( T7 RNA polymerase,T7 RNAP) 及其强启动子之间的特异性和转录的高效性建立的pET 系统( Novagen)是最常用的E. coli 表达系统。T7 RNAP 机制在诱导蛋白表达时,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白...

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常见的真核和原核表达系统的启动子(promoters)

真核启动子启动子  主要用途RNA转录本   描述表达备注CMV常规表达用mRNA人类巨细胞病毒来源的强哺乳动物表达启动子组成型 可能包含一个增强子,在某些细胞中会沉默EF1a常规表达用mRNA人延长因子1α来源的强哺乳动物表达启动子组成型 表达水平十分稳定,与细胞类型无关SV40常规表达用mRNA猿猴空泡病毒40来源的哺乳动物表达启动子组成型 可能包含一个增强子PGK1 (人/小鼠)常规表达用mRNA磷酸甘油酸酯激...

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DNA甲基化与限制性内切酶

你有没有用过XbaI或者ClaI酶?有没有遇到过比较奇葩的现象?你是否了解DpnI能消化模板DNA而不能消化掉新合成的DNA的原理?——以上都是因为相同的原因:DNA的甲基化。为什么是甲基化?限制性内切酶在实验室中随处可见,人们很容易忘记这些细菌来源的酶的真正功能。原核细胞为了保护自己,选择性地降解外源DNA,可保护个体免于外来DNA(如噬菌体)侵入的系统,主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。限制内切酶负责降解进入原核细胞的外源DNA,甲基化酶则对细胞自身的DNA进行甲基化,从而保护细胞的...

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如何提高昆虫杆状病毒表达系统重组蛋白表达水平?

利用转基因动物(包括绵羊,山羊,猪,大鼠,奶牛等) 生产各种重组蛋白和工程疫苗是近年来的热点之一。但是,转基因动物研究过程中存在许多问题,例如生产重组蛋白所需时间长、生产量过低等。相对而言,昆虫细胞表达系统(包括杆状病毒表达系统和稳定转化细胞系统)所需时间较短,效率更高,特别是昆虫杆状病毒表达系统已被广泛地应用于高等真核生物蛋白的生产,它是利用携带有外源目的基因的重组病毒做载体在昆虫体内或培养细胞内进行表达的一个生产系统。因为昆虫细胞与哺乳动物细胞翻译和翻译后蛋白修饰的模式与能力相似,包括糖基化...

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多功能融合标签——多聚精氨酸(R9)

将重组蛋白与阳离子多肽(如九聚精氨酸, R9)融合是一种将重组蛋白转入哺乳动物细胞内的方法。许多阳离子多肽具有穿透细胞的能力,这些多肽可以作为蛋白转导结构用于转运小分子药和大分子(如蛋白质)。尽管转运的具体机制还不是特别清楚,但是这些多肽自身携带的大量正电荷对穿透功能是至关重要的。可能是通过正电荷与细胞表面的阴离子分子(如硫酸肝素)的库伦作用完成的。研究表明,多肽的长度和阳离子多肽的组成对内化作用十分重要,一般认为7-9氨基酸是最优的,而且精氨酸由于赖氨酸。与小分子不同,蛋白质的构象很脆弱,而且...

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如何提高质粒的产量?

绝大部分时间,质粒抽提是个小case也很简单,挑取单克隆后培养一段时间,用个试剂盒就能搞定。通常可以获得超过100ng/ul 的质粒,这对于常规实验如PCR,亚克隆,转染或者长期储存来说足够了。但是总有些时候,事情不尽如人意,那么如何提高质粒的产量就是我们今天要探讨的话题。 质粒的拷贝数质粒拷贝数是指在特定培养基中一个细菌细胞中质粒的个数。这个数字主要由质粒的复制起点(replication origin)决定,同时也受到插入片段的大小和性质,菌种,生长条件等因素影响。如果手头上的质粒...

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质粒载体与转录终止子和polyA

用于基因表达的质粒载体根据载体上的功能元件,可以划分为两类:原核的和真核的。无论是原核系统还是真核系统,质粒DNA 都必须转录成RNA,这个过程可以划分为三步:1.起始,2.延伸,3.终止。本文我们主要讨论转录的终止。什么是转录终止和聚腺苷酸化?转录终止子(序列决定)界定了一个转录单元的结束(比如说基因)和新合成的RNA从转录机器上释放过程的开始。转录终止子位于基因的下游,通常紧跟着poly(A)位点后面。许多研究集中在启动子的强度跟基因的表达水平的关系,而事实上,转录终止子影响RNA加工过程和...

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一种无缝克隆方法——Gibson 组装

过去的十多年间,科学家们发明了很多种构建克隆的方法。这些方法相较于最经典的限制性内切酶克隆方法而言,各有优缺点。传统的限制性内切酶克隆技术,会在两个片段的结合位置上形成一道“疤”或“缝”,这种瑕疵可能会对DNA片段的行为产生微妙的影响。这一点特别令合成生物学家头疼,因为他们常常要将启动子和终止子这样的DNA片段转变为可预测的独立元件。今天我们就来说说一种无缝克隆方法。 Gibson组装Gibson组装最早由Daniel Gibson博士和他的同事J. Craig Venter在2009...

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蓝白斑筛选

今天我们讲讲一种很经典的重组子筛选技术——蓝白斑筛选。先介绍下两种非常常用的蓝白斑筛选质粒pUC18和pUC19。背景:细菌的乳糖操纵子(lac)包含一个叫lacZ的基因,它编码的蛋白是β-半乳糖苷酶。乳糖操纵子可以被乳糖或者乳糖类似物IPTG给激活,启动下游基因的表达。(严格的来说,IPTG是与lac阻遏物结合,让它失活来启动lac的表达的)。β-半乳糖苷酶可以降解一种连接有染料的底物(X-gal,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷),生成半乳糖和一种不溶于水的蓝色色素。蓝白斑筛选试验...

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