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几种测定生物大分子结构的方法

目前蛋白质三维结构的测定主要有三大手段:X射线晶体学、核磁共振技术(NMR)以及冷冻电镜三维重构技术。这些研究方法都有其优点和缺陷,不同的研究对象需要采用不同的方法。X射线晶体学是目前分辨率最高的结构测定方法,但是首先要拿到蛋白质晶体,分子量很大的蛋白以及膜蛋白很难得到晶体,这是其局限性。核磁共振光谱学比较适合研究小分子量(通常小于20kDa)的蛋白和蛋白相互作用位点的信息,而冷冻电镜比较适合研究超大分子量蛋白复合物(通常远大于100kDa)甚至亚细胞器的结构;因此往往需要通过结合不同的方法来互...

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X射线晶体学之蛋白结晶

利用X射线衍射法研究生物大分子结构,最困难的常常是晶体的获得。目前,生物大分子单晶的培养还没有上升到理论高度,主要依赖于经验。影响生物大分子结晶的因素1. 待结晶物质的纯度:一般来说要求待结晶物质的纯度越高越好;除了纯度,还要关注微观层面上的构象均一性和化学均一性。2. pH值:pH值能影响蛋白的溶解度,甚至有时候会一起蛋白变性。需要根据蛋白性质选择合适的pH值,有时候不同pH值条件下会得到不同晶型的晶体。3. 沉淀剂:沉淀剂的加入可以改变溶液中生物大分子之间的相互作用力,即可以改变生物大分子在...

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X射线晶体学的研究步骤

X射线晶体学的研究步骤如下:①蛋白或DNA样品纯化②结晶③衍射、数据收集④确定蛋白结构衍射数据→数据处理→相位解析→建模→模型修正→模型检验⑤理解结构与功能的相互关系对于上述过程,我们挑选几个步骤稍微详细阐述下。衍射数据收集在获得晶体之后,就要做衍射数据收集,即用X射线打到晶体上,产生衍射,并记录衍射数据。X射线的来源主要有两种,一种是在常用X射线仪上使用的,通过高能电子流轰击铜靶(或钼靶),产生多个特征波长的X射线;另一种就是利用同步辐射所产生的X射线,其波长可以变化。上海光源就是利用同步辐射...

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结构修正与结构评价指标

蛋白质的起始模型,常由于相角的解不够完美,使计算出来的电子密度图产生误差,误导模型的走向,因此需要做进一步的改善,称为修正(refinement)。结构模型的误差来源有1)生物大分子结晶不完美,导致的衍射强度低,误差大;衍射数据分辨率有限;2)相角推算过程引入的误差;3)电子密度的解释和模型构建过程引入的认为的误差。所以为了改进结构模型和衍射数据之间的吻合程度同时保持结构模型的立体化学合理性,就必须要调整参数对结构模型进行修正。通常对结构可靠性判断的依据有两个重要指标:一个是R因子(Rwork)...

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AutoDock实例教程

本文讲述大分子受体与小分子配体的分子对接过程。只是记录一遍流程,该扩展的地方如果有空再写文详述。1.软件安装及工作目录创建下载安装包MGLTools1.5.6(当前版本,2017年12月16日),按照提示安装即可。注意安装的时候地址中不要含有中文,以免不可知的问题。安装好之后,在安装目录下找到adt.bat,右键发送一个快捷方式到桌面。比如安装目录为:D:\Program Files (x86)\The Scripps Research Institute ,那么adt.bat文件则位...

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X射线晶体学之常见问题

1. 蛋白质修饰如糖基化会不会影响蛋白结晶?在蛋白结晶过程中,糖基化一般被认为会影响蛋白的均一性和表面熵,从而阻碍蛋白结晶。但是也有实验表明糖基化不会影响蛋白质结晶(10.1021/cg7006843),应该无差别对待。如果糖基化蛋白不能形成晶体,那么就应该尝试将糖链给去掉。有好几种方法可以去掉糖侧链:1)先用PNGase去掉所有的N-连接的糖;2)然后再用内切糖苷酶,如Endo F1, F3, Endo H这些进行消化,它们会在Asn残基上留下一个GlcNAc;3)如果内切糖苷酶不起作用,那么...

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微卫星不稳定性MSI/MMR(错配修复)

MSI/MMR检测可用于有效地评估PD-1单抗免疫治疗在癌细胞治疗中的效益。MSI(Microsatellite instability,微卫星不稳定性),是指由于在DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象,常由错配修复(MMR)功能缺陷引起。MSI现象于1993年被Jacobs等人在结直肠癌中首次发现,与癌症发生有关,可用于癌症检测。微卫星序列(MS),又称简单重复序列(SSR),是一些短而重复的DNA序列,一般由1-6个核苷酸组成,串联重复排列,常见类型为双碱基CA/GA或单...

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蛋白质结构与功能研究技术路线

蛋白质参与行使几乎所有的细胞功能。为了行使其特定的功能,蛋白质必须折叠成特定的结构。蛋白质结构研究可帮助对其功能机制的深入理解,也可帮助进行药物筛选及设计优化。蛋白质生物化学功能主要有结合、催化、分子开关以及细胞骨架等。哺乳动物细胞中蛋白质超过一半是酶。蛋白质结构的稳定性是其发挥生物功能必需的,三级结构由非共价和共价两类相互作用稳定,其中非共价相互作用为主。下表是稳定蛋白质结构的化学相互作用。键名键长键能共价键(C-C)共价键(C-C)356kJ/mol610kJ/mol(C=C双键)二硫键2....

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抗体制备常用表达系统

从目前的趋势推断,未来抗体及抗体衍生物分子将占据生物治疗药物的1/3以上。用于治疗用途的单抗药物的生产将会是表达系统的开发及优化的主要驱动力。市场上绝大多数的全长单抗都是用哺乳动物细胞生产的,主要是CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)或者CHO衍生的工程细胞。这个平台已经成熟,通过复杂的筛选过程和通过昂贵培养基的驯化,几乎可以将抗体表达量推向了细胞的生理极限。然而,哺乳动物细胞能否依然保持其优势主导地位,未来依旧不可知。尽管如此,生物仿制药的出现将推动建立低成本、高扩展性的新型表达平台。其他抗体生产手...

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常用蛋白标签、序列及特性总结

常见表位标签和序列标签蛋白质序列FLAGDYKDDDDK3 x FLAGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDKHAYPYDVPDYAHisHHHHHHHSVQPELAPEDPEDMycEQKLISEEDLV5GKPIPNPLLGLDSTXpressDLDDDDK或DLYDDDDKThrombinLVPRGSBAD(生物素受体域)GLNDIFEAQKIEWHEFactor XaIEGR或IDGRVSVGYTDIEMNRLGKSV40 NLSPKKKRKV或PKKKRKVGProtein CED...

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