纽普生物

定制多抗

问: 我该选择定制单克隆抗体还是多克隆抗体呢?
答: 单克隆抗体和多克隆抗体的最大的区别在于特异性上的差别。因此实验中如果对抗体的特异性有一定的需求,但并不是特别强调的话,可以选择定制多克隆抗体,这样的实验一般包含Western-Blot(WB),IP等。如果您需要抗体用于流式细胞术时,那么最好选择单克隆抗体。另外,在研究很多新的蛋白时,并不确定新蛋白是否很重要,是否会是将来很长一段时间的研究重点,所以抗体用量也不大。在定制新的蛋白的抗体时,我们强烈建议首先制备多抗用于实验,当得到了理想的实验结果并需要长期的使用该抗体时再考虑制备单抗。最后,一般修饰性抗体大多数研究员会选择定制多克隆抗体,比如甲基化抗体等,这主要是从抗体的制备难度上来考虑的。
问: 我该选多肽还是蛋白作为抗原呢?
答: 还是要根据抗体应用于什么实验来决定
1.实验过程中蛋白处于天然状态,这时使用的抗体识别的一般是蛋白的构象表位和线性表位;这样的实验主要有CO-IP、FACS、Neutralizing/Blocking以及Elisa法检测天然蛋白等
2.实验过程中蛋白处于变性或半变性状态,这时大部分的构象表位已被破坏,抗体识别的一般都是线性表位;这样的实验主要有:Western、IHC/ICC/IF等以多肽作为抗原制备的抗体,识别的是线性表位,在使用时蛋白处于变性或半变性状态下,结果可以令人满意;但不能够保证识别天然蛋白以蛋白作为抗原制备的抗体,识别蛋白的线性和构象表位,基本上所有的实验都可以应用,所以,用蛋白作为抗原应是首选,但是在多肽抗原已可满足实验要求而且得到蛋白有一定难度的情况下,以多肽作为抗原制备抗体更加合适。
问: 什么情况应该考虑用设计多肽做抗原?
答: 如果氨基酸序列已知,但是由于基因克隆或表达等原因得不到抗原蛋白,或者仅需要得到针对抗原蛋白某几个特定表位的抗体,就可以采用多肽合成的方式得到抗原。例如仅需要生产针对蛋白质某个区域的特异抗体,比如研究蛋白质N端的前体物,可以设计N末端的多肽抗原。如果抗体的使用目的是识别修饰的氨基酸,如磷酸化的丝氨酸、苏氨酸或者酪氨酸,乙酰化赖氨酸等,就必须对多肽进行相应的修饰。一般情况下抗血清能够识别用来免疫的多肽序列,但是不一定识别天然蛋白质的折叠结构。非连续性抗原的抗体能否识别抗原决定簇取决于用于抗体生产的多肽是否存在二级结构。
问: 蛋白上的标签是否会影响抗体制备?
答: 通常重组蛋白上的GST(谷胱甘肽S-转移酶)或MBP(麦芽糖结合蛋白)标签分子量较大,含有许多抗原位点,在免疫时会成为抗原从而影响特异性抗体的制备。所以作为抗原的重组蛋白最好不带有GST或MBP标签。一些小分子量的标签,如His、Myc、Flag基本不会影响特异性抗体的制备。NovoPro用于制备抗体的蛋白通常采用此类小分子量标签。
问: 我该怎样选择酶标二抗?
答: 实验中在选择二抗时必须注意以下几点:
(1)一抗种属来源
主要根据一抗种属来源来决定确定二抗的类型,如一抗是小鼠来源,那二抗就买抗小鼠的即可(如羊抗小鼠、兔抗小鼠等均可)。
(2)一抗类型
二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体.
单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。
如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合。
在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下,可以选用抗相应物种IgG。
(3)标记物的选择
一般来讲,耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,PAP),荧光基团(FITC, RRX, TR, PE)和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于western blot和ELISA,最常用的二抗是酶标二抗,而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学,组织免疫化学,流式细胞术)中通常使用荧光基团标记的二抗,免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号,可以使用biotin/avidin检测系统。
问: 同一公司的不同抗体用某个稀释度对一种抗体效果好,另外一种抗体可不可以用同种稀释度进行稀释?
答: 不同抗体,即使是同一公司的抗体,其最佳的抗体稀释度也是不一样的,需要进行实验摸索。
问: 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗?
答: 免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。
问: 抗体该如何保存?
答: 1. 收到抗体后请务必在12000rpm离心1-5分钟后再打开管盖进行分装和保存(如果抗体体积小于50ul,请延长离心时间至5分钟,以保证全部抗体均离心下来)!
2. 对于大部分抗体,比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃ or -80℃ 。
(1)对绝大多数抗体来说,保存在-20℃是完全足够了。没有任何证据显示保存在-80℃会有更多的好处! 
(2)分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害,同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。 
(3)分装的量以一次实验用完为好,最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小,抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响 
(4)复融后的分装抗体如果一次用不完,将剩余母液保存在4℃,避免再冻起来! 
(5)抗体工作液应该当天配制当天用完,在4℃ 尽量不要超过1天。 
(6)绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。尽量将抗体保存在冰箱里层,而不是门上 
3. 大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。
如果抗体很快(1-2周)会使用,推荐在4℃保存,这是为了避免反复冻融对抗体活性的损害。如果要长期保存则最好是在-20℃ or -80℃。最关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体!
但是,腹水形式的产品请在收到后立即冻起来!因为该类产品含有大量的蛋白酶,长期在4℃保存会导致抗体的降解!
4. 大部分抗体的运输条件:一般的运输过程需要1-2周的时间,所以是在4℃的条件下来完成的。
   4℃运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害(如果使用干冰运输,那么收到时抗体是冻起来的,为了分装就需要解冻。这就多了一次冻融的过程)。所以运输过程中绝对避免干冰运输!
5.特殊抗体的保存条件: 
--酶联抗体:永远保存在4℃,避免冻起来。否则会导致酶活性的下降或者丧失 
--偶联抗体:所有偶联抗体都需要在棕色管中或使用锡箔纸避光4℃保存。尤其是荧光抗体,对光极为敏感,因此在所有的实验阶段也是要避光操作的! 
--IgG3的同型对照:永远保存在4℃,避免冻起来。因为如果出现冻融过程,该抗体非常容易形成多聚体无论是保存还是运输,绝对避免反复冻融! 
反复冻融会导致抗体变性,导致多聚体形成,从而降低抗体的结合能力!
6.抗体保存其它相关信息: 
(1)关于加入甘油保存: 
有些人会加50%的甘油到抗体中来避免反复冻融,甘油在-20℃ 会降低冰点。这对很多抗体可能是可行的。加入甘油的溶液不建议在-80℃保存,因为这已经超过了甘油的冰点。如果您要加入甘油来保存抗体的话,请谨慎注意无菌操作,避免污染!
(2)关于蛋白保护剂: 
蛋白在高浓度时更不容易降解(1 mg/ml 或者更高),这就是为什么在抗体中加入BSA之类作为稳定剂的原因了;另一方面,加入的蛋白也可以减少抗体由于管壁吸附所造成的损失。但是如果抗体要用来标记的话,则不能加入蛋白稳定剂,因为这些稳定剂会和抗体一起竞争结合标记物。
(3)关于叠氮化钠(sodium azide)的使用: 
为了防止微生物污染,叠氮化钠经常被加入到抗体中(终浓度0.02% (w/v))。有些抗体已经含有了0.02%-0.05%的叠氮化钠,在说明书的“Storage buffer”中有标明的。在下述情况中不能使用叠氮化钠:
• 如果抗体用于染色或处理活细胞,用于体内研究:叠氮化钠在抵抗微生物的同时,对其它大部分有机物也是有毒的,因为它阻断了线粒体的cytochrome electron transport system.
• 要偶联带有氨基基团的抗体:叠氮化钠会干扰任何含有氨基基团的偶联,因此在进行偶联之前,应将叠氮化钠去除。偶联后的抗体可以加入叠氮化钠保存,但是浓度只能是0.01%。对于需要偶联的抗体,thimerosal (merthiolate)可以替代叠氮化钠作为保护剂!
注:叠氮化钠的去除方式: 可以通过透析或过滤的方式去除!IgG的分子量是150kDa (IgM 是~ 600kDa); 叠氮化钠的分子量只有65Da。使用cut off 14kDa的滤膜即可将叠氮化钠从抗体中去除
问: 如何在Western Blot检测时提高大分子量蛋白的转印效率?
答: ① 增加转印时间。
② 在转印缓冲液中添加0.01%或0.02%的SDS以提高蛋白从胶中转出的效率。
③ 减少转印缓冲液中甲醇的量。
④ 使用低浓度的胶更利于转印。
问: 在使用PVDF膜做Western Blot时,怎样消除背景?
答: 使用PVDF膜时需要经过多步严格的封闭过程。可以通过增加2-5倍封闭液的浓度,延长封闭时间(如封闭液孵育过夜)和在37℃下进行封闭来提高效果,通过封闭液与空位点结合来消除背景,并与膜蛋白结合降低其与一抗的非特异性结合。 一些常用封闭液有脱脂奶粉,BSA和干酪素。
问: 如果我想提供抗原制备抗体,需要提供多少抗原?
答: ① 如果您的抗原是合成多肽,通常需要5mg以上。对于需要做亲和纯化的项目,需要额外提供3-4mg多肽。提供的多肽要求是冻干粉。
② 如果抗原是蛋白,建议您提供3-5mg浓度为1mg/ml以上的蛋白并注明蛋白保存的缓冲液和蛋白浓度。对于需要做亲和纯化的项目,需要额外提供3-4mg蛋白用于亲和纯化。 该量同时适用于单抗和多抗的常规制备。
问: 纽普生物是如何做抗原设计的?
答: 我们会对您所要制备抗体的蛋白全长序列进行分析,来设计1-5条多肽。多肽的亲水性、疏水性、空间结构、β折叠倾向、表面可接触性、同源性以及多肽长度(通常10-20个氨基酸)在多肽设计时都会考虑在内,确保多肽最好的免疫原性。客户的意见和合成的方便程度也是多肽设计时需要考虑的。
问: 为什么有些目的蛋白 WB 很难检测到目标条带?
很多时候检测不到目的条带的问题竟都是出在样本制备这一步。质粒有没有转染到细胞中去,转进去后有无表达,表达量是否足以用 WB 检测,目的蛋白是否容易降解?想要得到最佳实验结果,了解清楚这些问题比一遍一遍优化和改进 WB 操作本身更为重要。

相信若非首次接触 WB 实验的科研同行,每人都应有一套成熟的实验方案可行而有效,若目的蛋白检测不到,可适当根据 CST 推荐的操作步骤优化调整,但更需要的,还是在蛋白制备上下功夫,可参考如下:
1. 选择最佳转染方法。
2. 检测 mRNA 水平。
3. 提取蛋白的细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解;如果需要检测磷酸化蛋白,请加入磷酸酶抑制剂。
4. 测定蛋白表达量,低表达的蛋白需要浓缩目的蛋白样本至可检测浓度, 确认你的上样量达到 20 μg。
5. 考虑刺激处理是否合理。
6. 通常我们建议采用超声处理细胞和组织提取物,而且超声对于研究细胞核和核染色质相关蛋白至关重要,如组蛋白 H3。
问: 为什么 WB 样本处理要超声?如果没有超声仪,有什么替代方法?
相较于单独裂解缓冲液,超声处理破碎细胞膜和核染色质的程度更大。我们推荐在 35%-40% 功率下处理 10-15 s,重复 3 次,每次间隔时间 30 s,全程将样品试管置于冰上,可完全裂解细胞以打碎核染色质,减少样品的粘稠度,对于检测膜结合蛋白和核蛋白非常重要。
但每个超声仪的最佳设置需单独确定,若成熟可自行决定处理条件。如果没有超声波破碎仪,可选用细的 21 G 针头抽吸样品来破碎。如果样本太黏稠,可先用 16 或 18 G,然后再用 21 G。
问: 如果样本制备这个过程都已做得妥妥的,还是没有信号,怎么办?
1. 有无过度洗膜洗掉一抗。CST 科学家经过自己验证,推荐在 TBS/0.1% Tween-20 中清洗三次,每次 5 分钟。
2. 有无过度封闭 ( 例如超过 1 小时或者过夜封闭,会减少特异信号 )。
3. 抗体是否有问题,我们提供专门的细胞裂解物对照来检测您的抗体是否存在问题,这是最好和最快捷的方法。
问: 做磷酸化抗体的时候一定要用脱脂奶粉稀释吗?
一些客户认为在做磷酸化抗体的时候,用脱脂奶粉来封闭会引起比较高的背景,并且喜欢用 PBS 来作为稀释液,但这些说法是没有科研依据的。CST 的技术专家团队推荐用 5% 脱脂奶粉,TBS,0.1% Tween® 20,室温下 1 小时来封闭一抗。
问: 转膜时,对大分子量和小分子量蛋白,该如何选择膜孔径?
对所有的蛋白,我们推荐用 Nitrocellulose Sandwiches #12369(0.2 μm)的杂交膜去转膜,尤其是分子量低于 30 KD 的蛋白,建议使用较高浓度(12-15%)的蛋白分离胶并缩短转膜的时间,建议在 1 小时以内。
大分子量蛋白(> 150 kDa)推荐使用 tris-acetate SDS-PAGE 凝胶系统,而不是传统的(tris-glycine),以及 5% 的甲醇。因为 tris-acetate 凝胶是在一个中性 pH 的条件下,所以分辨率比较高而且迁移的也更加精准。
低浓度的甲醇可以使转膜的效率更高(25 mM Tris base,0.2 M glycine,5% methanol)。长时间的转膜(3 小时,70 伏)也是很有帮助的。对 mTOR 来说长时间的转膜可能不一定有效,因为 mTOR 是个高表达蛋白,一般来说用常规的 protocol 也可以得到比较好的实验结果,但是对于 BRCA1,ATM,ATR 等这些大分子量蛋白还是十分有帮助的。