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多功能融合标签——多聚精氨酸(R9)

将重组蛋白与阳离子多肽(如九聚精氨酸, R9)融合是一种将重组蛋白转入哺乳动物细胞内的方法。许多阳离子多肽具有穿透细胞的能力,这些多肽可以作为蛋白转导结构用于转运小分子药和大分子(如蛋白质)。尽管转运的具体机制还不是特别清楚,但是这些多肽自身携带的大量正电荷对穿透功能是至关重要的。可能是通过正电荷与细胞表面的阴离子分子(如硫酸肝素)的库伦作用完成的。研究表明,多肽的长度和阳离子多肽的组成对内化作用十分重要,一般认为7-9氨基酸是最优的,而且精氨酸由于赖氨酸。与小分子不同,蛋白质的构象很脆弱,而且...

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如何提高质粒的产量?

绝大部分时间,质粒抽提是个小case也很简单,挑取单克隆后培养一段时间,用个试剂盒就能搞定。通常可以获得超过100ng/ul 的质粒,这对于常规实验如PCR,亚克隆,转染或者长期储存来说足够了。但是总有些时候,事情不尽如人意,那么如何提高质粒的产量就是我们今天要探讨的话题。 质粒的拷贝数质粒拷贝数是指在特定培养基中一个细菌细胞中质粒的个数。这个数字主要由质粒的复制起点(replication origin)决定,同时也受到插入片段的大小和性质,菌种,生长条件等因素影响。如果手头上的质粒...

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质粒载体与转录终止子和polyA

用于基因表达的质粒载体根据载体上的功能元件,可以划分为两类:原核的和真核的。无论是原核系统还是真核系统,质粒DNA 都必须转录成RNA,这个过程可以划分为三步:1.起始,2.延伸,3.终止。本文我们主要讨论转录的终止。什么是转录终止和聚腺苷酸化?转录终止子(序列决定)界定了一个转录单元的结束(比如说基因)和新合成的RNA从转录机器上释放过程的开始。转录终止子位于基因的下游,通常紧跟着poly(A)位点后面。许多研究集中在启动子的强度跟基因的表达水平的关系,而事实上,转录终止子影响RNA加工过程和...

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一种无缝克隆方法——Gibson 组装

过去的十多年间,科学家们发明了很多种构建克隆的方法。这些方法相较于最经典的限制性内切酶克隆方法而言,各有优缺点。传统的限制性内切酶克隆技术,会在两个片段的结合位置上形成一道“疤”或“缝”,这种瑕疵可能会对DNA片段的行为产生微妙的影响。这一点特别令合成生物学家头疼,因为他们常常要将启动子和终止子这样的DNA片段转变为可预测的独立元件。今天我们就来说说一种无缝克隆方法。 Gibson组装Gibson组装最早由Daniel Gibson博士和他的同事J. Craig Venter在2009...

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蓝白斑筛选

今天我们讲讲一种很经典的重组子筛选技术——蓝白斑筛选。先介绍下两种非常常用的蓝白斑筛选质粒pUC18和pUC19。背景:细菌的乳糖操纵子(lac)包含一个叫lacZ的基因,它编码的蛋白是β-半乳糖苷酶。乳糖操纵子可以被乳糖或者乳糖类似物IPTG给激活,启动下游基因的表达。(严格的来说,IPTG是与lac阻遏物结合,让它失活来启动lac的表达的)。β-半乳糖苷酶可以降解一种连接有染料的底物(X-gal,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷),生成半乳糖和一种不溶于水的蓝色色素。蓝白斑筛选试验...

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大肠杆菌表达菌株

常用的大肠杆菌表达菌株外源重组蛋白的表达往往表达量非常高,远远超过细菌自身蛋白的表达水平,从而会导致细胞生长缓慢。另外,有些蛋白对细菌有毒性,特别是那些不可溶的,作用于DNA的,以及具有酶活性的。因为这个原因,我们一般会用工程改造的大肠杆菌来表达重组蛋白。 有些很重要的突变可以兼容很高的蛋白表达水平:ompT:携带这个突变会导致外膜蛋白酶VII的缺失,而外膜蛋白酶VII会降解表达出的蛋白。hsdSB (rB- mB-): 携带这个突变会形成失活的限制性内切酶/甲基化系统,从而不会让外源...

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破坏Cdk5能抑制肿瘤细胞的PD-L1的表达,促进抗肿瘤免疫反应

在一项新的研究中,来自美国凯斯西储大学医学院的研究人员研究了一种被称作周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)的关卡蛋白,它也是一种在神经细胞和肿瘤细胞发展中起着至关重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。他们特地研究Cdk5在成神经管细胞瘤(medulloblastoma)---一种常见的生长迅速的儿童脑瘤---发展中的作用。他们发现这种关卡蛋白允许某些脑瘤细胞(如成神经管细胞瘤)躲避免疫系统检测。相关研究结果发表在2016年7月22日那期Science期刊上,论文标题为“Cdk5 disruption att...

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Sci-Hub 最新可用网址(17年12月 6日更新)

2017年 12 月 06 日更新:有两个地址不可用,新增一个地址。 顺带推荐一款浏览器扩展: Pubmedy:显示影响因子+引用数、Sci-hub全文下载的浏览器扩展 很多人都知道一个下载文献的好地方 Sci-Hub,但是现在 Sci-Hub 的站长 Alexandra Elbakyan 女士面临着爱思唯尔的诉讼,让其面临数百万美元的赔偿。因此现在 Sci-Hub 在某些时候可能不可用了。不过 Alexandra E...

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包涵体纯化蛋白复性专题汇总

1.       什么是包涵体蛋白? 重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达的时候经常导致蛋白聚集而形成不溶的、无活性的包涵体。包涵体一般由蛋白质、DNA和脂类物质组成,密度比水大,约1.3mg/ml,易于分离。包涵体蛋白中存在一些与蛋白的天然构象类似的二级结构,所以可以用非变性浓度的去垢剂直接将某些蛋白溶解出来,得到有活性的蛋白质。由于包涵体中通常含有细菌的外膜蛋白OmpT,它是个蛋白酶,能在4-8M尿素条件下降...

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史上最全癌症靶向药(2016精华收藏版)

在最近过去一年的时间里,FDA陆续批准了9个癌症靶向新药,此外还批准了4个抗癌药物新增适应症。然而,在这些癌症靶向药物当中,仅有25.4%在中国上市。 令人欣慰的是,有些患者已经到美国就诊并使用到了一些新药,为战胜癌症增加了筹码。更加可喜的是,目前很多新药的临床试验正在国内开展,例如免疫疗法药物PD-1抑制剂Nivolumab和Pembrolizumab以及肺癌靶向药Osimertinib(AZD9291)等。 希望中国的患者能早日受益于这些新药。根据疾病种类和...

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