纽普生物

结构生物学常见问题解答(FAQ)

1. DMSO影响结晶吗?

影响,尽量不要用DMSO。

2. 糖基化和磷酸化都影响结晶吗?

磷酸化不太影响,糖基化影响比较大。但是糖基化修饰蛋白要不要去糖得试了才知道,不是说去糖就一定更好。

3. 结构生物学预算:

结构一般的预算就是文章影响因子每1分10万。

4. 衍射数据处理,用HKL3000/2000对数据处理,不解析结构, 价格是多少?

价格是2500元,交付.sca和.log文件。

5. 分子对接方式

对于蛋白和小分子对接:Autodock vina 对接;

对于蛋白和蛋白分子对接:我们用ZDOCK

交付结果中会标注所有的关键氨基酸残基。包括距离和残基链接方式,比如:

1111.png

2222.png

6. 底物类似物是什么 (Substrate analogs)?

就是能结合蛋白的,跟底物结构很像,但是不与蛋白发生反应的分子。在共结晶的时候通常需要底物类似物,而不是底物。

直接用底物与蛋白结晶,会发生反应,通常没有办法得到共结晶。如果蛋白催化的是一个可逆反应,那么另当别论,我们已经做出好多个成功案例。

7. 常用结构生物学软件及教程:

结构模型查看,分析及作图软件:PyMol, Discovery Studio, Chimera等(网上都有免费版本下载);

PyMol:

https://sourceforge.net/projects/pymol/

DS:

https://www.3dsbiovia.com/products/collaborative-science/biovia-discovery-studio/visualization-download.php

Chimera:

https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

分析蛋白是否形成多聚体及相互作用界面分析:PISA,网址:http://www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/

蛋白与配体结合位点预测:https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/COACH/

分子对接(柔性):AutoDock,http://mgltools.scripps.edu/downloads

AutoDock实例教程:http://www.novopro.cn/articles/201712271167.html

查看电子云密度图,结构验证:

Coot 

https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/

8. PyMol高级版安装方法:

http://www.novopro.cn/articles/201906121184.html

9. 蛋白-小分子项目价格?

蛋白结构价格5-15万。小分子-蛋白复合物:7.5-15万。

小分子要求uM 级别亲和力,最好是nM级别。需要提供详细的亲和力测定方法。大于10uM的话需要单独评估。

同时需要小分子的 A.分子量;B. 水溶性

如果可以的话提供小分子的结构我们可以先做一个蛋白与小分子的分子对接。看看小分子与蛋白的结合方式。

10. 多肽结晶方法?

多肽结晶需要合成去TFA的多肽,尽量98%纯度以上的多肽;

没有同源结构的多肽,需要在普通多肽结晶条件确定以后,合成硒代多肽。

因为多肽本质上是一个混合物(盐+水+多肽+其他杂质),加上构象并不稳定,所以结晶并不容易。

多肽纯度和应用:

Purity Application

>85% Immunological applications and polyclonal antibody production

>90% SAR studies, bioassays

>95% In vitro bioassays such as ELISA, enzymology, biological activity

>98% NMR, crystallography, sensitive bioassays

详细信息可以参考:https://www.novoprolabs.com/custom-peptide-synthesis/  最后的FAQs部分。

11. 外泌体是否能做冷冻电镜?

理论上可以做,但是非常难,最好找全球最厉害结构生物学家合作,是一个CNS级别的大项目。

12. 跨膜蛋白结晶的难度在哪:

A. 蛋白非常难表达,需要用去垢剂让蛋白均一。

B. 蛋白结晶也非常困难;收数据一般去日本的Spring8收,那里X光强度更高,适合做膜蛋白;

C. 结构解析也需要专业的人来解析。

需要做不同的突变,不同的截取,耗时非常长,成功概率非常低。

13. 做结晶蛋白运输条件:

一般冰袋4度运输就可以了。有条件可以干冰运输。如果蛋白不稳定4度2-3天就沉淀了,那么后续点结晶的时间也是没有办法稳定的,长结晶一般需要几天-几个月。

14. 无同源结构怎么办

一般来说无同源结构需要做硒代,如果明确的知道蛋白可以结合Fe,Zn,Cu等重原子,可以尝试同晶置换方式解析结构。如果蛋白特别短,二级结构特别简单,也可以使用直接法来解结构,比如这样的是一个完整的Helix的蛋白:

 4444.png

15. 冷冻电镜做病毒的尺寸限制:

80nm 以下比较常规,100nm以下可以尝试。超过100nm会非常难做。

16. 结晶蛋白为什么需要测试活性

因为重组蛋白或者提取的天然蛋白,不知道结构和折叠是否正确,需要通过活性测定来确保是有功能的,间接说明蛋白的结构是正确的。

17. 无同源结构蛋白结构解析的收费

无同源结构一般来说要比普通蛋白贵1倍,因为无同源结构需要同时做出普通蛋白和硒代蛋白共两套数据,并且解出结构。因为需要做2个单独项目而且需要同时成功,硒代蛋白表达成本也较高,所以无同源结构蛋白项目成本会高至少一倍。

18. 筛晶体的具体流程:

点结晶:

采用1比1 悬滴法 ,  池液200 ul.

筛选条件:

HamptonResearch HR2-144

HamptonResearch HR2-110

HamptonResearch HR2-112

HamptonResearch HR2-107

HamptonResearch HR2-109

HamptonResearch HR2-116

HamptonResearch HR2-117

HamptonResearch HR2-126

HamptonResearch HR2-098

Qiagen Cat No./ID: 130724

Qiagen Cat No./ID: 130725

Qiagen Cat No./ID: 130726

Qiagen Cat No./ID: 130727

moleculardimensions MD15-W1-T

moleculardimensions MD15-W2-T

moleculardimensions MD15-W3-T

moleculardimensions MD15-W4-T

moleculardimensions MD15-C1-T

moleculardimensions MD15-C2-T

Qiagen Cat No./ID: 130715

Qiagen Cat No./ID: 130718

Qiagen Cat No./ID: 130701

Qiagen Cat No./ID: 130723

Qiagen Cat No./ID: 130720

Greiner 673101

Greiner

自制配方 3775

19. 晶体筛选试剂盒和机器人照片:

 6666.jpg

 777.png

20. 观察结晶可以用机器人吗?

目前都是肉眼观察,根据经验来判断是否可以优化,用什么方法优化。

21. 筛晶体需要消耗的蛋白量

根据蛋白摩尔质量的不同和点样摩尔浓度的不同,每1000个条件筛选消耗2.5mg-10mg蛋白。不同浓度需要尝试不同池液。

找到了有希望的条件,再根据这个条件进行优化。

22. 筛晶体对于沉淀的样品是否有规律来优化

优化基本上需要靠实验人员的经验。对于沉淀的样品,优化会很困难,一般需要做突变,截取,或者改变表达体系。条件微调对于做不出来的蛋白,尤其是沉淀的蛋白来说提升不大。

23. 不同批次的蛋白混合在一起影响结晶吗?

最好是同一批次的,实在不行纯度合格也可以接受。

24. 项目调整我们会给建议吗?

一般会的,但是A. 客户要理解合理性,比如突变掉1-2个氨基酸,很多客户特别抵触,我们也没办法;其实只要把握结构与功能是挂钩的这一点,对我们的建议就比较容易接受了。B. 有时候蛋白-小分子复合物结构项目需要类似物,这个需要客户懂催化机理,根据催化机理来修改结构,合成出类似物,要求较高。

25. 结晶项目的成功率是多少?

整体成功率是50%左右。

26. 难度大的项目会接吗?

完全没希望的会拒绝。有30%成功概率的会考虑,10%的特殊情况下会考虑。

27. 蛋白化学合成可以做结晶吗?

60aa以下的蛋白可以用多肽合成的方法来制备,纯度大于98%即可。

28. 蛋白-小分子,蛋白-蛋白分子对接

价格是1500元/组。提供10个概率最优结果,并对最优结果分析相互作用情况。http://www.novopro.cn/service/docking/

29. 冷冻电镜服务类型

冷冻电镜只有2种:

1. 项目比较容易,觉得有把握的,我们可以全套都做了;

2. 项目比较复杂,客户制样负染,负染数据合格的话我们提供收数据+解结构服务。

30. 蛋白-蛋白分子对接可以3个蛋白之间对接吗?

不可以,目前只接2个蛋白之间的分子对接。

31. 鉴定两个蛋白是否可以结合,是否可以做分子对接

分子对接不行,分子对接是假设蛋白之间有结合,然后通过对接的方式预测它们可能的结合方式。验证蛋白是否结合,可以将两个蛋白孵育过分子筛,看看分子筛图谱上有复合物单峰出现,然后测定蛋白-蛋白亲和力。

32. 蛋白-底物/小分子结构解析,设计蛋白突变的原则:

我们希望突变氨基酸有3个特点:

1. 距离底物近,周围可以互相作用的;

2. 根据催化反应类型,推测可能参与的氨基酸类型

3. 位于loop区,因为催化活性残基大概率是在loop区的,而且其他区域突变会影响蛋白结构。可以参考文章:http://www.novopro.cn/articles/201905221182.html

Souce: 纽普生物    2019-11-18