作者：解螺旋·翠花
今天的内容是由翠花在解螺旋干细胞群中跟大家分享来自Cell Stem Cell杂志的的《MSC-Regulated MicroRNAs Converge on the Transcription Factor FOXP2 and Promote Breast Cancer Metastasis》文献精读。
一、摘要：
a) 乳腺癌细胞异质性，含有基质细胞，组成了肿瘤微环境；
b) 已有报道，乳腺癌和基质细胞的相互作用，乳腺癌发生的关键因素；
c) 肿瘤细胞对来自微环境的信号具有高响应性；
d) 基于抑制肿瘤和基质的交互信号，可能是潜在的肿瘤治疗策略；
e) 已有报道，肿瘤干细胞MSC作为催化剂促进癌症进展、侵袭和转移，在其他肿瘤也有报道（肺癌，前列腺癌，结肠癌），提示MSC具有潜在的促癌活性，常常被募集到肿瘤；
f) 从乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌分化的MSC确实具有显著的恶性表型。然而分子机制未明；
g) 从基质细胞作用下肿瘤细胞miRNA的改变入手，研究基质对乳腺癌转移的影响；
h) FOXP2是转录抑制因子，参与调节语言发育和神经发育。在肺和食管的组织分化中发挥作用，但跟肿瘤的关系尚无报道；
i) 本文充分证实了这个语言基因在乳腺癌转移中的关键角色，同时揭示了肿瘤间质诱发的miRNA调节网络。
二、剖析研究思路
1. miRNA筛选，获取研究对象
1.1 芯片筛选
通过芯片筛选，在MSC共培养刺激的MDA-MB-231中，获得6个表达上调的miRNA (≥2-fold; adjusted p <0.05): miR-199a-3p、miR-34a、miR-762、miR-214、miR-let-7b和miR-1915。
qPCR验证结果与芯片筛选结果一致。miR-199a-3p在MSC共培养刺激的MDA-MB-231中的表达水平提高了65倍引起作者关注。miR-199a-3p在喉癌、胃癌和肺癌中的表达水平显著提高，预示着可能在乳腺癌恶性进展过程发挥关键作用。补充材料显示：在跟MSC先共培养后分离并继续单独培养3天的MDA-MB-231中，miR-199a-3p高表达仍旧持续。
1.2 对miR-199-3p追根溯源
Tips：pri-miRNA是microRNA从DNA上转录出来的初级转录本，有可能较长，上千bp，有可能仅有100bp左右。
目前还没有pre-miRNA和成熟miRNA的数据库。可以通过一些生物信息学方法去推测，如通过组蛋白标记H3K27me进行推断，最终需要通过5‘RACE和3'RACE去证实到底长度。作者接下来获取了miR-199a-3p在人类基因组中的位置：19号染色体和1号染色体，命名为miR-199a1 (A1) 和miR-199a2 (A2)。接下来检测两个pri-miRs，发现A1上调了60%， A2 上调了40%。miR-199a2是由DNM3OS的内含子转录的，这个区段同时编码miR-214。有趣的是，miR-214也同时在芯片筛选中发现，qPCR验证结果显示，上调了15倍。miR-199a-3p (A1和A2位置) 和miR-214 (仅A2 位置) 在MSC诱导的乳腺癌中可能具有协同功能。
1.3 排除模型特异性
miRNA的诱导需要MSC-BCC 直接接触（Boyden小室实验证实了间接接触后miRNA未被诱导表达）。先换BCC，发现把MDA-MB-231换成MCF7/Ras、T47D和MDA-MB-435后，都获得了一致结果。检测到的miR-199a-3p和miR-214的表达率，有所差异， 再换MSC，发现把MSC换成成纤维细胞（WI-38，人的胚胎肺成纤维细胞）或者脂肪间充质干细胞（ad-MSCs），没有发现miR-199a-3p 和miR-214的高表达。继续换MSC，发现换成乳腺衍生的MSCs (Br-MSCs)或者激活的成纤维细胞(CAFs，来源于乳腺癌) 导致miR-199a-3p 上调，miR-214无变化。结论：骨髓间充质干细胞可能是唯一有能力活化A1和A2两个位点的MSC，而miR-199a-3p激活是乳腺癌细胞对肿瘤间质产生响应的关键元素。
2.对芯片筛选的miRNA，验证功能表型
2.1 建立两个miRNA过表达细胞模型
由于miR-199a-3p和miR-214可能是由一个基因转录而来的，所以，miR-214可能对miR-199a2的作用有干扰。作者推测MSC诱导的乳腺癌细胞，可能具有异质性，有些细胞可能表达两个miRNA，有些细胞只表达miR-199a-3p。接下来要研究miR-199a-3p功能，就要建立两个模型：采用慢病毒感染的方法在MDA-MB-231细胞中稳定过表达表达内源性的miR-199a-3p命名为BCC199a，稳定过表达两个miRNA的命名为BCC199a/214。qPCR结果检测发现，miR-199a-3p表达上调40倍，miR-214表达上调了3倍。
2.2 体内实验验证两个miRNA对转移的影响
将BCC199a和BCC199a/214分别皮下接种，成瘤大小与对照组没有显著差异。出现肺转移，且转移能力较对照组提高3倍。提示两个乳腺癌细胞miRNA过表达模型在体内实验条件下，对转移有促进作用，对增殖无影响。
2.3 体外实验验证两个miRNA对转移的影响（排除EMT机制）
2-D培养条件下，与对照细胞（BCCnull）相比，对细胞增殖的影响没有变化，同体内结果。检测间质标记物（vimentin、N-cadherin、SMA、LOX），也没有发现显著提高。这表明，在体内所观察到的促进转移的表型，不是通过EMT机制，可能有别的分子机制。
2.4 miRNA对干细胞特性的影响
目前研究发现，肿瘤干细胞在肿瘤发生以及肿瘤转移、耐药、复发等过程中均起关键作用，而肿瘤干细胞微环境则在肿瘤干细胞干性维持、分化以及肿瘤发生发展中发挥至关重要的调控功能。作者之前研究已经发现：MSC激活会增加BCC中干细胞的比例，表现为ALDH1阳性细胞增加和微球形成能力提升。作者用极限稀释法，也验证了高转移性的BCCMSC成瘤能力比对照细胞显著提高2.5倍，哪怕是在单次注射100个肿瘤细胞的情况下。作者就推测BCC199a 和BCC199a/214增加的转移能力跟他们获得的肿瘤干性有关。
研究显示，两个细胞模型抵抗失巢性死亡的能力提高，凋亡率降低。此外，两个细胞模型都显示了在低附着条件微球体生长能力增加，qPCR实验和ALDEFLUOR?荧光试剂系统（快捷的非抗体分析方法）检测到干细胞的标记物乙醛脱氢酶（ALDH1）的表达水平和阳性比率显著提高。更重要的是，他们都具有提高的肿瘤始发能力（体现在单次注射100个细胞，形成肿瘤的能力是BCC空载细胞的2-3倍）。
2.5 确定对干细胞特性影响的关键miRNA——miR-199a-3p
由于BCC199a 和BCC199a/214增强的转移能力，是接近的，说明在两个miRNA过表达的BCC199a/214细胞所体现的表型中，miR-199a发挥了绝对主导的作用。接下来专注研究miR-199a。为了鉴别199a-3p和199a-5p的区别，作者用合成的RNA duplexes，形成特异性的成熟的5p或者3p。研究发现，瞬时表达199a-3p导致ALDH1提高了2.5倍，而199a-5p没有这个作用。就证实了miR-199a-3p在miR-199发挥促进肿瘤干性形成的过程中发挥关键作用。
接着就去研究miR-199，发现除了会促进ALDH1表达，也会促进其他乳腺癌干细胞标记物的表达，比如MYC 、GD2S和POSTN。此外，在其他乳腺癌细胞株MCF7/Ras、T47D和MDA-MB-435中，稳定过表达miR-199a都会导致ALDH1阳性率增加若干倍，以及在T47D细胞中上调POSTN，和CD44 high/CD24 low的比例。在MCF7/Ras细胞MYC的表达增加。再次排除细胞特异性。尾静脉注射BCC199a细胞导致超过65%的老鼠形成了转移灶，而注射对照细胞BCCnull的小鼠没有形成转移灶。以上结果提示：miR-199a诱导的干性是对于肿瘤细胞二次定殖至关重要。
3.对芯片筛选的miRNA，寻找靶基因，验证靶基因
3.1 数据库预测miRNA靶基因
接下来揭示分子机制。选择文献已经报道的21个miR-199a-3p (或者miR-214)的靶基因，在BCC199a 和BCC199a/214 中检测靶基因的表达是否下调。结果，在两个细胞中没有发现一致的结果。提示了体内细胞环境对研究miRNA的重要性。
为了鉴定BCC199a 和BCC199a/214中miRNA 的效应，再次进行芯片筛选，关注那些与肿瘤细胞干性获得或者维持有关的因素。
3.2 寻找跟干细胞调节有关的基因，获取FOXP2
选择84个已经报道的与干性保持和维持的基因（Human Stem Cell PCR Array，QIAGEN， #PAHS-501Z，都是转录因子），qPCR检测其在BCC199a 和BCC199a/214中的表达水平。与BCCnul相比，一系列干性相关的基因表达上调。包括GATA-binding protein-6/GATA6、lin-28 homolog B/Lin28B 、homeobox C9/HOXC9和msh homeobox 2/MSX2。意外的是，发现只有forkhead box P2/ FOXP2在两株细胞中均显著下调(≥fold; p < 0.005)，在BCC199a 和BCC199a/214 中的下调倍数分别是7倍和13倍。并通过qPCR实验验证了芯片结果。蛋白水平，FOXP2也受到显著抑制。此外，在BCCMSC中，与BCC相比，FOXP2也受到显著抑制。
由于FOXP2的缺失，是维护祖细胞分化的关键。作者推测，FOXP2下调可能在鉴定CSC表型发挥作用。接下来在MDA-MB-231MSC细胞中流式分选ALDH1阳性的细胞（具有肿瘤起始能力），检测FOXP2表达，发现抑制率达95%。为了排除细胞模型特性，发现在过表达miR-199a的T47D 中也会出现增强的细胞干性和FOXP2的显著下调。以上研究表明，FOXP2下调与肿瘤细胞干性维系直接相关。
3.3 FOXP2的功能验证
接下来验证FOXP2的功能，采用RNAi干扰手段，为了排除脱靶效应，构建了8个shRNA载体。其中两个干扰序列被证实有效，命名为shFOXP2-1.5和shFOXP2-2.2，他们导致FOXP2蛋白水平的抑制率达到70%。在这两个FOXP2沉默的细胞株中，ALDH1阳性率显著提高。除了ALDH1这个干细胞标记物，还发现OCT4 和c-Myc的表达提高，以及CD44high/CD24low比率提高了2倍。微球体形成能力也提高2.5倍，失巢凋亡抵抗能力提高。
裸鼠成瘤实验显示，单次注射BCCshFOXP2-2.2 和对照细胞，都有28%的成瘤率，但接种浓度低至100个细胞时，对照细胞没有成瘤，BCCshFOXP2-2.2仍有25%成瘤率。以上体外和体内实验结果显示，FOXP2抑制可产生与肿瘤干细胞一致的表型。然而，在体外模型和体内模型中，BCC199a/214和BCCshFOXP2并没有显著出提高的肿瘤增殖促进潜能。接着考察其对转移的影响，用转移灶数量与原发灶肿瘤质量这个指标衡量转移，发现BCCshFOXP2接种后，与对照组（BCCshSCRAM）相比，转移能力提高了9倍。
4.1 样本获取：
从TCGA数据库，GEO数据库挖掘乳腺癌测序数据。
4.2 FOXP2的临床意义TCGA数据库，GEO数据库挖掘乳腺癌测序数据
发现与正常组织相比，乳腺癌原发灶中FOXP2的表达降低4倍。进一步发现，与乳腺良性病变组织相比，浸润性导管癌组织中， FOXP2的表达降低2倍。为了确认FOXP2的表达是否与乳腺癌的亚型具有相关性，专门去分析公开获取的luminal A (n = 13)、luminal B(n = 22)、HER2阳性(n = 26)和basal-like乳腺癌(n = 27)表达数据库。结果发现与正常组织相比（n=2），所有的乳腺癌亚型中，FOXP2都普遍下调。作者获取了74例乳腺癌组织标本[HER2 (n = 12), Lum A (n = 25), Lum B (n = 25), and BLBC (n = 12)]和5例正常组织，qPCR检测FOXP2的表达差异，发现FOXP2 在肿瘤组织的抑制率为80%。进一步分析发现，在独立样本中，FOXP2低表达与整体无病生存率和无远处转移生存率呈负相关。表明，临床上FOXP2抑制是乳腺癌恶性的风险因素。
4.3 miRNA的临床意义
与原位导管癌相比，在浸润性导管癌组织中，miR-199a-3p的表达显著提高。在一个大于600例浸润性导管癌组织标本的研究中发现，miR-199a-3p 的表达水平与疾病的预后有关，且与淋巴结阳性(N1 或者N2)显著相关。miR-199a-3p 在发生复发的肿瘤患者的原发灶中显著高表达，也与降低的5年和10年存活率相关。
综上结果显示，FOXP2和miR-199a-3p 的表达失调，是乳腺癌恶性进展的常见特征，是潜在的预后因子。
5. 从靶基因的角度阐明FOXP2和miRNA负调控关系的分子机制
5.1 从miRNA靶基因的角度
采用RNAhybrid、miRWalk、Targetscan和Pictar 分析，FOXP2 近端(1kb) 3’ UTR ，寻找miR-199a-3p的结合位点。在结合自由能≤-25 kcal/mol的条件下，仍发现一无所获。然而这些预测方法确实发现了其他miRNA的结合位点，如miR-762、miR-let-7b、miR-34a和miR-1915，它们都是前文提到的MSC诱导表达的miRNA。
基于此，作者就研究这几个miRNA是否能否抑制FOXP2的表达。结果显示，在MDA-MB-231细胞中，不论是稳定表达miR-762 或者miR-1915（PCR扩增方式从人基因组DNA调取颈环结构的前体序列，亚克隆至miRNA表达载体），还是瞬时表达miR-let-7b或miR-34a 的miRNA mimics，都可以显著降低FOXP2 的表达水平。
同时，在这些细胞中，无一例外的， ALDH1 阳性率上升。其中，miR-let-7b、miR-34a、miR-762和miR-1915所产生的ALDH1阳性率分别上升了20、75、30和30倍。
5.2 从miRNA调节网络的角度
miR-199a-3p没有靶向FOXP2近端的3’ UTR，作者推测miR-199a是否通过上述四个miRNA抑制FOXP2。作者的推测得到印证，发现在BCC199a/214中miR-let-7b、miR-34a、miR-762和miR-1915的表达水平提高了7、4.5、5和4.5倍。提示这些miR-199a-3p有共调节的miRNA分子集合。接下来在乳腺癌临床组织标本中，验证了miR-199a-3p的表达水平跟miR-let-7b、miR-34a和miR-1915，呈正相关（miR-762未能检出，可能是因为实验的敏感性所限，需要大量的原始RNA样本）。这些结果印证了在乳腺癌中，MSC诱导的miRNAs存在交互调控，提供了miR-199a-3p 抑制FOXP2表达的分子机制。
进一步的，Kaplan-Meier分析和Cox多因素分析，表明miR-199a-3p、miR-let-7b、miR-34a和miR-1915的过量表达是乳腺癌整体预后不良预测因子。也说明了miRNA网络是乳腺癌强大的、显著的临床预后指标。
三、思路总结
这是一个延续性工作, 作者之前报道了MSC激活的BCC，EMT标记物富集和EMT表型明显，其机制主要由LOX 通过CD44-Twist通路介导的。本研究中，作者观察到，乳腺癌细胞中的CCL5、LOX表达不能触发miR-199a-3p/miR-214 表达，与之前CCL5和LOX 并不能促进干细胞样表型的结论一致。但意外的是，Twist 表达能够促进miR-199a-3p和miR-214 表达，抑制FOXP2，Twist 表达对于获得MSC诱导的A1/A2 位点是必要的。以上结果显示，MSC引发的EMT 和干细胞样特性，存在交互调节。
Cuiffo et al., 2014, Cell Stem Cell 15, 762-74;
El-Haibi CP et al., 2012, Proc Natl Acad Sci U S A 109(43):17460-5.
2015-07-22