mTOR信号通路的简单激活途径

Oncotarget. 2014 Jan; 5(1): 49-66.

关于mTOR通路，你将了解：

• mTOR蛋白的的发现与鉴定；

• 主要研究手段；

• mTOR信号通路对肿瘤中的调节；

• mTOR信号通路对物质代谢和能量代谢的调节。

1蛋白发现

mTOR，全名mammalian target of rapamycin，雷帕霉素受体蛋白，而目前主要的是研究集中在哺乳动物，所以加了一个mammalian。它是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇 3-激酶相关激酶( pho sphatidy linosito l 3-kinase-related kinase , PIKK)蛋白家族，在细胞生长、增殖、分化、细胞周期调控等多个方面起到重要作用。

值得一提的是，它是一种真核生物中非常保守的一种蛋白激酶，可想而知，在真核细胞的生命组织中必然起到非常重要的作用，参与了最最最基本的生命活动，细胞的生长、增殖、细胞的物质与能量代谢；而对于高等多细胞生物，参与了发育等其他生理过程。

通过功能上的描述，其重要性不言而喻。而对于高等生物，细胞与细胞间的联系远远比单细胞生物要多得多，细胞的生长发育分化等必然受到个体整个的宏观层次的调控，那么从逻辑上推测，mTOR必然也要受到细胞外信号等多方面的调控，于是mTOR逐渐进化成了能够响应外部信号的一种蛋白激酶。

当然，只能响应外部信号还是不够的，细胞经过这么多年的进化，它的聪明程度远超我们的想象。试想一下，这么一种几乎控制整个细胞运转的蛋白，如果复杂的外来信号影响mTOR，如果mTOR的功能实现形式单一，那么细胞的自稳态必然受到破坏，那岂不是细胞非常不智能？所以，这么一种特殊的蛋白激酶，它的活化与失活必须受到非常精密的调控，于是细胞发展起来一套庞大的蛋白复合体可以调控它的活性，来自不同的信号可以通过不同的蛋白来实现对mTOR的调节，综合到mTOR的活性身上就反应了细胞的稳态维持程度。当然mTOR对下游的调节也是必须精确严密的，后续给与具体介绍。

简单的说，mTOR的发展进化正反映着生命从单细胞到多细胞组织形式过度的内在需求和维持细胞稳态的外部需要。作为一种受体蛋白，是一类具有免疫抑制活性的小分子雷帕霉素和FK506的受体。然而最初的鉴定是通过酵母突变株筛选得到的。Rapamycin可以结合FKBP12，在芽殖酵母中结合FKBP12的同系物，抑制的酵母的细胞周期从G1到S期的过渡。通过基因筛选的办法晒出了Rapamycin抵抗株，鉴定出了TOR1和TOR2两个蛋白。但是在我们哺乳动物中不可能通过大量的突变筛选啊，怎么办? 科学家基于这样一个事实，rapamycin可以诱导FKBP12与靶标蛋白TOR的结合。那么在真核生物中，它们用P32标记的FKBP12，在rapamycin存在的情况下和细胞裂解液或分离纯化的组织裂解液组分孵育，再通过交联剂将结合蛋白共价交联在一起，鉴定出了特异性结合的分子量大约235KD的蛋白。

图1 在哺乳动物细胞中鉴定特异性被rapamycin诱导的FKBP12的结合蛋白的鉴定手段

图2 特异性检验证实了rapamycin诱导FKBP12结合的目的蛋白条带是特异性的

构建GST-FKBP12的蛋白pulldown相关结合蛋白。并结合高效液相色谱，MS和蛋白测序，发现已有蛋白数据库中23个裂解肽段并无很好的匹配标的，显示该蛋白可能是一个全新的未鉴定过的蛋白，而与TOR1和TOR2相比对却有高达16个匹配，提示可能是其哺乳动物中的同源物。而后利用分子生物学手段从大鼠cDNA文库中钓出该蛋白的全DNA ，rapamycin and FKBPlP targets 1（RAFT1），也就是后来的mTOR。

图3鉴定新的蛋白RAFT1蛋白的基本路线

首次鉴定mTOR的科学家，David M. Sabatini，1994年当时他还只是约翰霍普金斯大学医学院的在读博士生，现在已经是whitehead的研究员，同时也是The Howard Hughes Medical Institute（HHMI）研究员。他的实验室完全建立在mTOR的研究上，可以说mTOR领域他是绝对的引领者。

这里面还有个小插曲，David经过努力，当时从基因组钓出了rapamycin-FKBP12的两个特异性结合蛋白RAFT1和RAFT2。RAFT1大概200多Kd，RAFT2大概35kd。

David试图通过DEAE、CM等多种色谱柱分离，再以非变性PAGE分离这两个蛋白，却都失败了。RAFT1和RAFT2在非变性条件下无法分离，David给出的解释是可能是存在于一个复合体中，或者RAFT2是RAFT1的一个裂解形式，包含rapamycin-FKBP12的结合位点。虽然有更多可能的解释，似乎RAFT2与RAFT1的共复合体的可能性不是很大，因为如果这样，在前面试验中，共价交联后的放射活性也许就不存在，甚至有可能是体外实验中人为产生的RAFT2（这仅是小编个人以为）。不过重要的是，David并没有被这个问题绊住手脚，也许他自己也心存困惑，不过可以确定的是RAFT1这个200多Kd的蛋白，于是果断回避RAFT2的相关问题，抓住特异性的RAFT1，即使在分离蛋白的时候，也仅一句RAFT2和GST-FKBP12位置相近，无法看到。因为RAFT1一个蛋白的鉴定就足矣。

即使到目前为止，也似乎没有对这个35Kd分子量的RAFT2有什么发现，说明当时David的决定多么明智。一篇文章也不可能也没有必要解决所有的问题，这或许对我们在科研遇到困惑的难以解决的问题的时候，也有一定的借鉴意义。

作者：解螺旋.蛋炒饭 解螺旋出品

2015-07-22