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几种测定生物大分子结构的方法

目前蛋白质三维结构的测定主要有三大手段:X射线晶体学、核磁共振技术(NMR)以及冷冻电镜三维重构技术。这些研究方法都有其优点和缺陷,不同的研究对象需要采用不同的方法。X射线晶体学是目前分辨率最高的结构测定方法,但是首先要拿到蛋白质晶体,分子量很大的蛋白以及膜蛋白很难得到晶体,这是其局限性。核磁共振光谱学比较适合研究小分子量(通常小于20kDa)的蛋白和蛋白相互作用位点的信息,而冷冻电镜比较适合研究超大分子量蛋白复合物(通常远大于100kDa)甚至亚细胞器的结构;因此往往需要通过结合不同的方法来互补。

X射线晶体学

X射线晶体学是一门利用X射线来研究晶体中原子排列的学科。更准确地说,利用电子对X射线的散射作用,X射线晶体学可以获得晶体中电子密度的分布情况,再从中分析获得关于原子位置和化学键的信息,即晶体结构。所需要的样品是大分子晶体,这是该技术最大的瓶颈和难点。

基本流程:获得晶体,衍射数据收集,数据分析,晶体结构解析,建立和改进分子模型。

核磁共振技术(NMR)

核磁共振是指核磁距不为零的核,在外磁场的作用下,核自旋能级发生赛曼分裂,共振吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程。即原子核在磁场中吸收一定频率的无线电波而发生核自旋能级跃迁现象。最大的特点是可以直接在溶液中测定自然状态的大分子三维结构。但是因为大分子量的生物大分子的核磁共振图谱非常复杂,难以解释,因此它只能测定分子量较小的生物分子。样品要求: 高纯度且数量相对较多。目前NMR测定的最大结构:30-40kDa;而X射线晶体学测定的最大结构:2500kDa。而且NMR的图谱识别需要手工完成,没有自动化的图谱识别方法,耗时易错。

电镜三维重构

电镜三维重构技术是电子显微技术、电子衍射与计算机图像处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。尤其适合于分析难以形成三维晶体的膜蛋白以及病毒和蛋白质-核酸复合物等大的复合体的三维结构。其基本步骤是对生物样品在电镜中的不同倾角下进行拍照,得到一系列电镜图片后再经过傅里叶变换等处理,从而展现出生物大分子及其复合物三维机构的电子密度图。特点是极速冷冻样品悬液,然后样品就被包埋在无定型的非晶态冰薄膜中,这样既不损伤样品,又可使样品保持着自然状态,因为样品制备简单。缺点是分辨率稍低。

分辨率的意义

分辨率小于6埃,能反映大分子的大致轮廓

分辨率小于4.5埃,可分辨多肽链的走向

分辨率小于2.5埃,可分辨侧链的形态和方向

分辨率小于1.5埃,可分辨原子间的相互关系

Souce: 纽普生物    2017-12-27