pCMV-COLGALT1(human)-3xFLAG5683 bp60012001800240030003600420048005400CMV enhancerCMV promoterSV40 intronCOLGALT1(NM_024656)3xFLAGSV40 poly(A) signalM13 revlac operatorlac promoterCAP binding siteoriAmpRAmpR promoterM13 fwd

基本信息

载体名称
pCMV-COLGALT1(human)-3xFLAG
载体抗性
Ampicillin
Refseq ID
NM_024656.4
载体长度
5683 bp
载体类型
Protein expression
复制子
ori
宿主
Mammalian cells
启动子
CMV
5'引物
CMV-F
载体标签
3xFLAG
感受态
DH5a
培养温度
37℃
表达方法
Transient
描述
Homo sapiens collagen beta(1-O)galactosyltransferase 1 (COLGALT1), mRNA

质粒操作方法

质粒复溶方法

  1. 发货形式:质粒干粉,常温运输,收到后请于 -20 ℃ 保存,先转化提质粒再使用。
  2. 收到干粉后先 5000 rpm 离心 1 min,加入 20 μl ddH₂O 溶解。质粒复测浓度与标称值可能有差距,这通常来自干粉在管中的位置、复溶效率、测量偏差与管壁吸附,建议先转化提质粒后再使用。
  3. 取 1 支 100 μl 感受态细胞冰上解冻 10 min,加入 2 μl 质粒,冰浴 30 min,42 ℃ 热激 60 s(不要摇动),再冰浴 2 min。
  4. 加入 900 μl 无抗生素 LB 液体培养基,180 rpm、37 ℃ 振荡培养 45 min(30 ℃ 培养 1–1.5 h)。
  5. 6000 rpm 离心 5 min,保留约 100 μl 上清重悬菌体,涂布到对应抗性的 LB 平板。
  6. 平板倒置 37 ℃ 培养 14 h(30 ℃ 则 20 h)。菌落过多可稀释质粒后再转化;无菌落可增加至 10 μl 质粒。建议先转克隆感受态、重提质粒后再导入表达感受态。
  7. 挑取单菌落接种 LB 液体培养基,加入对应抗生素,220 rpm 振荡培养 14 h,按试剂盒说明提取质粒。

通用质粒转化方法

  1. 取100 μL感受态细胞置于冰上解冻10 min,加入2 μL质粒,冰浴30 min;随后42 ℃热激60 s,期间不要晃动,再冰浴2 min。
  2. 加入900 μL无抗LB液体培养基,37 ℃、180 rpm振荡培养45 min(30 ℃条件下则培养1–1.5 h)。
  3. 6000 rpm离心5 min,弃上清,仅保留100 μL上清重悬菌体沉淀,涂布于对应质粒抗性的LB平板上。
  4. 平板倒置培养,37 ℃培养14 h,或30 ℃培养20 h。
  5. 挑取单菌落至LB液体培养基中,加入对应抗生素,220 rpm振荡培养14 h;根据实验需求及质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

人COLGALT1 ORF 克隆 (NM_024656) (编号: V027096) 注释

LOCUS       V027096                 5683 bp    DNA     circular SYN 01-JAN-1980
DEFINITION  synthetic circular DNA.
ACCESSION   V027096
VERSION     V027096
KEYWORDS    .
SOURCE      .
  ORGANISM  .
            .
FEATURES             Location/Qualifiers
     enhancer        27..330
                     /note="human cytomegalovirus immediate early enhancer"
                     /label="CMV enhancer"
     promoter        331..534
                     /note="human cytomegalovirus (CMV) immediate early
                     promoter"
                     /label="CMV promoter"
     intron          672..768
                     /note="modified SV40 intron with splice donor and acceptor
                     sites"
                     /label="SV40 intron"
     CDS             870..2735
                     /label="COLGALT1(NM_024656)"
                     /note="COLGALT1(NM_024656)"
                     /gene="COLGALT1"
     CDS             2742..2807
                     /codon_start=1
                     /product="three tandem FLAG® epitope tags, followed by an
                     enterokinase cleavage site"
                     /transl_table=1
                     /translation="DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK"
                     /label="3xFLAG"
     polyA_signal    2822..2956
                     /note="SV40 polyadenylation signal"
                     /label="SV40 poly(A) signal"
     primer_bind     complement(3067..3083)
                     /note="common sequencing primer, one of multiple similar
                     variants"
                     /label="M13 rev"
     protein_bind    3091..3107
                     /bound_moiety="lac repressor encoded by lacI"
                     /note="The lac repressor binds to the lac operator to
                     inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
                     relieved by adding lactose or
                     isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
                     /label="lac operator"
     promoter        complement(3115..3145)
                     /note="promoter for the E. coli lac operon"
                     /label="lac promoter"
     protein_bind    3160..3181
                     /bound_moiety="E. coli catabolite activator protein"
                     /note="CAP binding activates transcription in the presence
                     of cAMP."
                     /label="CAP binding site"
     rep_origin      complement(3469..4057)
                     /direction=LEFT
                     /note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
                     replication"
                     /label="ori"
     CDS             complement(4228..5088)
                     /codon_start=1
                     /gene="bla"
                     /note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
                     related antibiotics"
                     /product="β-lactamase"
                     /transl_table=1
                     /translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFA,HPETLVKVKDAEDQLGARVGY
                     IELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEY
                     SPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDR
                     WEPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRS
                     ALPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGA
                     SLIKHW*"
                     /label="AmpR"
     promoter        complement(5089..5193)
                     /gene="bla"
                     /label="AmpR promoter"
     primer_bind     5667..5683
                     /note="common sequencing primer, one of multiple similar
                     variants"
                     /label="M13 fwd"