进行限制酶切割反应只需简单地将酶和DNA样品放在合适的反应缓冲液温育，其中DNA和酶的量、缓冲液的离子强度、温育温度和时间都依具体的反应而改变。 1.  混合下列溶液于一个无菌的微量离心管中 （1）x μl  DNA （2）2 μl  10×酶切缓冲液 （3）18-x μl  H 2 O ...

1.  按顺序安装带凹口的小玻璃平板或小矩形玻璃平板、0.75 mm 垫片、大矩形玻璃平板叠放在一起组装成夹层，并确保夹层放入多胶灌制装置后，垫片能安放妥当，两头均与玻璃平板的上下边缘对齐。 2.  将凝胶夹层紧密地安放在多板灌胶装置中，用丙烯酸隔板或聚碳酸酯薄片填满灌胶室的空位。 3.  安装制胶室的前面板，于硅胶密封衬条处用夹子固牢，检査证实玻璃平板和垫片的排放整齐。 4. ...

1.  用水性实验室去污剂彻底洗擦制胶用玻璃平板，接着用热水、去离子水、95%乙酵依次冲洗，晾干。 2.  用粘胶棒在玻璃平板的底部边缘擦上一道粘痕，快速地将Gel Bond 胶片以疏水面向下放在平板上，隔着kimswipe纸巾用力压，使之固定在平板上，从Gel Bond 背面的顶部将胶片掀起，往其下的玻璃面滴上几滴水，放下胶片，用油墨滚筒将之推平。 3.  按厂商的指南组装凝胶夹层。在组装前，用气体吹去Gel Bo...

1.  按“Laemmli凝胶电泳法”步骤1~4配制及灌制分离胶，同时凝胶应灌至玻璃平板夹层的顶部，按“Laemmli凝胶电泳法”步骤7，插入样品梳，并让凝胶在室温聚合30 ~60 min。 2.  蛋白质样品与2×磷酸/SDS样品缓冲液按1：1混合，于100℃加热2 min。 3.  按“Laemmli凝胶电泳法”步骤9~3，组装电泳装置和加样，缓冲系统采用磷酸/SDS电极缓冲液，如有空出的加样孔，加入等量的...

1.  参照“Laemmli凝胶电泳法”步骤1~4，配制并灌制分离胶。 2.  参照“Laemmli凝胶电泳法”步骤5~7，配制并灌制积层胶，但在移去分离胶顶层覆盖的异丁醇 时，以2×Tris·Cl/SDS，pH8.8而不用1×Tris·Cl/SDS缓冲液来冲洗分离胶表面。 3.  参照“Laemmli凝胶电泳法”步骤8~13，制备待测样品和加样。以2×SDS电泳电极缓冲液进行电泳，对照采用多肽分子量标准混合物...

1.  YAC中心实验室用于筛选文库的方法进展很快。 2.  将一块或多块微量滴定板微孔中的YAC克隆转印到尼龙膜上，用单拷贝探针进行杂交，就可以筛选YAC文库了。 3.  然而，由 于杂交实验的信噪比较低以及制备所有的转印尼龙膜所需的花费巨大，绝大多数实验室已采用PCR方法来筛选文库。 4.  这种方法首先是从克隆集中提取DNA，一般每个克隆集代表1~4块微量滴定板。 ...

1.  往微量滴定板的每孔中加入250 μl 含适当抗生素的选择性BHI培养液，并分别接种独立的cDNA克隆，37℃温育过夜。 2.  在250 ml 烧瓶中加入50 ml BHI/抗生素培养液，以10个克隆过夜培养液为一组， 从每个微孔中取100 μl 培养液，混合后接种到烧瓶中。 3.  37℃培养至A 590 =0.7，然后加入氯霉素继续于37℃温育...

用抗体筛选λgt11 cDNA文库时，可待噬斑长到一定裎度方可诱导表达融合蛋白，筛选到阳性克隆的成功概率就可能大大增加。噬菌体生长3~4 h 后，将含诱导剂IPTG的滤膜放入噬斑平板，即可诱导β-半乳糖苷酶-cDNA融合蛋白的表达，继续在37℃培养，然后按基本方案用抗体对影印滤膜进行筛选。 1.  用1×10 4 ~5×10 4 融合有cD...

1.  在150 ml LB 平板上滴定λgt11 cDNA文库的滴度，宿主菌为大肠杆菌LE392菌株，每个平板使用7 ml 1%LB顶层琼脂。 2.  选择适当的滴度铺平板，于37℃温育8 h。 3.  将直径132 mm 硝酸纤维素滤膜分别编号，放入上述已培养8 h的平板中，于37℃温育过夜。 4.  用针头刺孔并用印度墨汁在每张滤膜上作一标记，然后取出滤膜。 ...

分离纯化蛋白质，首先要从原材料中提取目的蛋白，然后通过粗分离的方法除去大量杂质，最后进行精细分离，得到目的蛋白。本实验以新型基因重组人TNF为例阐明重组蛋白TNF的提取及初步分离。   TNF的提取是将发酵菌体裂解，在一定的条件和溶液中，使被提取的TNF充分释放出来，经离心收集混合液中提取的TNF成份的过程。含有TNF的提取溶液中，含有大量的杂蛋白，由于蛋白质在水溶液中的溶解度主要取决于蛋白质分子表面的水分子数目，即蛋白质表面亲水基团与水分子形成水化膜的程度和带电荷的情况，当中...