基本信息
- 载体名称
- pEnCMV-Nppc(mouse)-Myc-FLAG-SV40-Neo
- 载体抗性
- Kanamycin
- Refseq ID
- NM_010933.5
- 载体长度
- 5259 bp
- 载体类型
- Protein expression
- 复制子
- ori
- 宿主
- Mammalian cells
- 筛选标记
- Neo/G418
- 启动子
- CMV
- 载体标签
- Myc-FLAG
- 表达方法
- Transient
- 描述
- Mus musculus natriuretic peptide type C (Nppc), mRNA
质粒操作方法
质粒复溶方法
- 发货形式：质粒干粉，常温运输，收到后请于 -20 ℃ 保存，先转化提质粒再使用。
- 收到干粉后先 5000 rpm 离心 1 min，加入 20 μl ddH₂O 溶解。质粒复测浓度与标称值可能有差距，这通常来自干粉在管中的位置、复溶效率、测量偏差与管壁吸附，建议先转化提质粒后再使用。
- 取 1 支 100 μl 感受态细胞冰上解冻 10 min，加入 2 μl 质粒，冰浴 30 min，42 ℃ 热激 60 s（不要摇动），再冰浴 2 min。
- 加入 900 μl 无抗生素 LB 液体培养基，180 rpm、37 ℃ 振荡培养 45 min（30 ℃ 培养 1–1.5 h）。
- 6000 rpm 离心 5 min，保留约 100 μl 上清重悬菌体，涂布到对应抗性的 LB 平板。
- 平板倒置 37 ℃ 培养 14 h（30 ℃ 则 20 h）。菌落过多可稀释质粒后再转化；无菌落可增加至 10 μl 质粒。建议先转克隆感受态、重提质粒后再导入表达感受态。
- 挑取单菌落接种 LB 液体培养基，加入对应抗生素，220 rpm 振荡培养 14 h，按试剂盒说明提取质粒。
通用质粒转化方法
- 取100 μL感受态细胞置于冰上解冻10 min，加入2 μL质粒，冰浴30 min；随后42 ℃热激60 s，期间不要晃动，再冰浴2 min。
- 加入900 μL无抗LB液体培养基，37 ℃、180 rpm振荡培养45 min（30 ℃条件下则培养1–1.5 h）。
- 6000 rpm离心5 min，弃上清，仅保留100 μL上清重悬菌体沉淀，涂布于对应质粒抗性的LB平板上。
- 平板倒置培养，37 ℃培养14 h，或30 ℃培养20 h。
- 挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220 rpm振荡培养14 h；根据实验需求及质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
小鼠Nppc ORF 克隆 (NM_010933) (编号: V030292) 注释
LOCUS V030292 5259 bp DNA circular SYN 01-JAN-1980
DEFINITION synthetic circular DNA.
ACCESSION V030292
VERSION V030292
KEYWORDS .
SOURCE .
ORGANISM .
.
FEATURES Location/Qualifiers
primer_bind 166..182
/note="common sequencing primer, one of multiple similar
variants"
/label="M13 fwd"
enhancer 343..722
/note="human cytomegalovirus immediate early enhancer"
/label="CMV enhancer"
promoter 723..926
/note="human cytomegalovirus (CMV) immediate early
promoter"
/label="CMV promoter"
promoter 952..970
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
/label="T7 promoter"
CDS 1029..1406
/label="Nppc(NM_010933)"
/note="Nppc(NM_010933)"
/gene="Nppc"
CDS 1425..1454
/codon_start=1
/product="Myc (human c-Myc proto-oncogene) epitope tag"
/transl_table=1
/translation="EQKLISEEDL"
/label="Myc"
CDS 1473..1496
/codon_start=1
/product="FLAG® epitope tag, followed by an enterokinase
cleavage site"
/transl_table=1
/translation="DYKDDDDK"
/label="FLAG"
primer_bind complement(1516..1532)
/note="common sequencing primer, one of multiple similar
variants"
/label="M13 rev"
polyA_signal 1543..2165
/note="human growth hormone polyadenylation signal"
/label="hGH poly(A) signal"
rep_origin complement(2314..2902)
/direction=LEFT
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
/label="ori"
polyA_signal 3231..3278
/note="herpes simplex virus thymidine kinase
polyadenylation signal (Cole and Stacy, 1985)"
/label="HSV TK poly(A) signal"
CDS complement(3510..4304)
/codon_start=1
/gene="aph(3')-II (or nptII)"
/note="confers resistance to neomycin, kanamycin, and G418
(Geneticin®)"
/product="aminoglycoside phosphotransferase from Tn5"
/transl_table=1
/translation="MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRP
VLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLS
SHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQ
GLAPAELFARLKASMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIA
LATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF*"
/label="NeoR/KanR"
promoter complement(4339..4696)
/note="SV40 enhancer and early promoter"
/label="SV40 promoter"
promoter complement(4698..4802)
/gene="bla"
/label="AmpR promoter"
rep_origin 4829..5257
/direction=RIGHT
/note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
indicates direction of (+) strand synthesis"
/label="f1 ori"