基本信息
- 载体名称
- pcDNA3.1-TMPRSS6(human)-3xFLAG
- 载体抗性
- Ampicillin
- Refseq ID
- NM_153609.4
- 载体长度
- 7876 bp
- 载体类型
- Protein expression
- 复制子
- ori
- 宿主
- Mammalian cells
- 筛选标记
- Neo/G418
- 启动子
- CMV
- 载体标签
- 3xFLAG
- 表达方法
- Transient
- 描述
- Homo sapiens transmembrane serine protease 6 (TMPRSS6), transcript variant 2, mRNA
质粒操作方法
质粒复溶方法
- 发货形式：质粒干粉，常温运输，收到后请于 -20 ℃ 保存，先转化提质粒再使用。
- 收到干粉后先 5000 rpm 离心 1 min，加入 20 μl ddH₂O 溶解。质粒复测浓度与标称值可能有差距，这通常来自干粉在管中的位置、复溶效率、测量偏差与管壁吸附，建议先转化提质粒后再使用。
- 取 1 支 100 μl 感受态细胞冰上解冻 10 min，加入 2 μl 质粒，冰浴 30 min，42 ℃ 热激 60 s（不要摇动），再冰浴 2 min。
- 加入 900 μl 无抗生素 LB 液体培养基，180 rpm、37 ℃ 振荡培养 45 min（30 ℃ 培养 1–1.5 h）。
- 6000 rpm 离心 5 min，保留约 100 μl 上清重悬菌体，涂布到对应抗性的 LB 平板。
- 平板倒置 37 ℃ 培养 14 h（30 ℃ 则 20 h）。菌落过多可稀释质粒后再转化；无菌落可增加至 10 μl 质粒。建议先转克隆感受态、重提质粒后再导入表达感受态。
- 挑取单菌落接种 LB 液体培养基，加入对应抗生素，220 rpm 振荡培养 14 h，按试剂盒说明提取质粒。
通用质粒转化方法
- 取100 μL感受态细胞置于冰上解冻10 min，加入2 μL质粒，冰浴30 min；随后42 ℃热激60 s，期间不要晃动，再冰浴2 min。
- 加入900 μL无抗LB液体培养基，37 ℃、180 rpm振荡培养45 min（30 ℃条件下则培养1–1.5 h）。
- 6000 rpm离心5 min，弃上清，仅保留100 μL上清重悬菌体沉淀，涂布于对应质粒抗性的LB平板上。
- 平板倒置培养，37 ℃培养14 h，或30 ℃培养20 h。
- 挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220 rpm振荡培养14 h；根据实验需求及质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
人TMPRSS6 ORF 克隆 (NM_153609) (编号: V025656) 注释
LOCUS V025656 7876 bp DNA circular SYN 01-JAN-1980
DEFINITION synthetic circular DNA.
ACCESSION V025656
VERSION V025656
KEYWORDS .
SOURCE .
ORGANISM .
.
FEATURES Location/Qualifiers
enhancer 235..614
/note="human cytomegalovirus immediate early enhancer"
/label="CMV enhancer"
promoter 615..818
/note="human cytomegalovirus (CMV) immediate early
promoter"
/label="CMV promoter"
promoter 863..881
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
/label="T7 promoter"
regulatory 913..922
/note="vertebrate consensus sequence for strong initiation
of translation (Kozak, 1987)"
/regulatory_class="other"
/label="Kozak sequence"
CDS 922..987
/codon_start=1
/product="three tandem FLAG® epitope tags, followed by an
enterokinase cleavage site"
/transl_table=1
/translation="DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK"
/label="3xFLAG"
CDS 991..3396
/label="TMPRSS6(NM_153609)"
/note="TMPRSS6(NM_153609)"
/gene="TMPRSS6"
polyA_signal 3476..3700
/note="bovine growth hormone polyadenylation signal"
/label="bGH poly(A) signal"
rep_origin 3746..4174
/direction=RIGHT
/note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
indicates direction of (+) strand synthesis"
/label="f1 ori"
promoter 4188..4517
/note="SV40 enhancer and early promoter"
/label="SV40 promoter"
CDS 4584..5378
/codon_start=1
/gene="aph(3')-II (or nptII)"
/note="confers resistance to neomycin, kanamycin, and G418
(Geneticin®)"
/product="aminoglycoside phosphotransferase from Tn5"
/transl_table=1
/translation="MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRP
VLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLS
SHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQ
GLAPAELFARLKARMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIA
LATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF*"
/label="NeoR/KanR"
polyA_signal 5552..5673
/note="SV40 polyadenylation signal"
/label="SV40 poly(A) signal"
primer_bind complement(5722..5738)
/note="common sequencing primer, one of multiple similar
variants"
/label="M13 rev"
protein_bind 5746..5762
/bound_moiety="lac repressor encoded by lacI"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
/label="lac operator"
promoter complement(5770..5800)
/note="promoter for the E. coli lac operon"
/label="lac promoter"
protein_bind 5815..5836
/bound_moiety="E. coli catabolite activator protein"
/note="CAP binding activates transcription in the presence
of cAMP."
/label="CAP binding site"
rep_origin complement(6124..6709)
/direction=LEFT
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
/label="ori"
CDS complement(6880..7740)
/codon_start=1
/gene="bla"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/product="β-lactamase"
/transl_table=1
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFA,HPETLVKVKDAEDQLGARVGY
IELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEY
SPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDR
WEPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRS
ALPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGA
SLIKHW*"
/label="AmpR"
promoter complement(7741..7845)
/gene="bla"
/label="AmpR promoter"