Note: pHEA is designed for bacterial surface display of polypeptides/nanobodies in E. coli.
基本信息
- 载体名称:
- pHEA
- 载体抗性:
- Chloramphenicol
- 载体长度:
- 4974 bp
- 载体类型:
- Protein expression
- 复制子:
- ori
- 宿主:
- E. coli
- 载体来源:
- Luis Ángel Fernández
- 拷贝数:
- High copy number
- 启动子:
- Lac
- 感受态:
- DH10B
- 培养温度:
- 37℃
产品信息
质粒编号:V014428
质粒名称:pHEA
规格:5 μg (冻干粉)
下载资源
我们所展示的质粒图谱主要是从文献和开放数据库中收集而来，主要是为了方便研究工作，其中一小部分质粒进行了质量控制，可供科学家使用。
确保质粒的关键元件正确，但是我们并不能保证实验效果。页面展示的图谱序列为理论序列，可能与测序结果不一致，请自行比对后确定是否满足要求。(如果测过序，本页面一般会提供下载)
开放数据库中的大多数载体序列都没有被完全测序。如果实际序列与参考序列的相似度超过99%，则将其视为正确。
由于科学研究是在探索未知，具有很大的不确定性，在任何情况下，我们都不承担超出质粒本身的额外经济损失或责任。
质粒操作方法
1. 发货形式：质粒干粉(常温运输，存于-20度，请务必先转化提质粒后使用)
2. 收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O溶解质粒;（质粒复测的浓度有时候与标称值差距较大，这可能是因为冻干质粒在管中的位置、复溶效率、测量偏差以及管壁的吸附导致，因此建议先转化提质粒后再使用）
3. 取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；
4. 加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min (30℃培养1-1.5小时);
5. 6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上;
6. 将平板倒置37℃培养14h，如果要求是30℃则培养20h; (菌落过多则将质粒稀释后再转化；没有菌落则加入10μl质粒转化；建议不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态);
7. 挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
pHEA 质粒 (编号: V014428)序列
LOCUS 62056_12275 4974 bp DNA circular SYN 01-JAN-1980
DEFINITION synthetic circular DNA.
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS .
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 4974)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..4974
/mol_type="other DNA"
/organism="synthetic DNA construct"
protein_bind 591..612
/label=CAP binding site
/note="CAP binding activates transcription in the presence
of cAMP."
promoter 627..657
/label=lac promoter
/note="promoter for the E. coli lac operon"
protein_bind 665..681
/label=lac operator
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
primer_bind 689..705
/label=M13 rev
/note="common sequencing primer, one of multiple similar
variants"
sig_peptide 741..806
/label=pelB signal sequence
/note="leader peptide for secretion"
CDS 807..824
/codon_start=1
/label=6xHis
/note="6xHis affinity tag"
/translation="HHHHHH"
rep_origin 2051..2506
/label=f1 ori
/note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
indicates direction of (+) strand synthesis"
CDS 2693..3349
/codon_start=1
/label=CmR
/note="chloramphenicol acetyltransferase"
/translation="MEKKITGYTTVDISQWHRKEHFEAFQSVAQCTYNQTVQLDITAFL
KTVKKNKHKFYPAFIHILARLMNAHPEFRMAMKDGELVIWDSVHPCYTVFHEQTETFSS
LWSEYHDDFRQFLHIYSQDVACYGENLAYFPKGFIENMFFVSANPWVSFTSFDLNVANM
DNFFAPVFTMGKYYTQGDKVLMPLAIQVHHAVCDGFHVGRMLNELQQYCDEWQGGA"
rep_origin 3684..4272
/label=ori
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
promoter 4337..4414
/label=lacI promoter
CDS join(4415..4974,1..520)
/codon_start=1
/label=lacI
/note="lac repressor"
/translation="VKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRVVNQASHVSAKTREKVEAAMAEL
NYIPNRVAQQLAGKQSLLIGVATSSLALHAPSQIVAAIKSRADQLGASVVVSMVERSGV
EACKAAVHNLLAQRVSGLIINYPLDDQDAIAVEAACTNVPALFLDVSDQTPINSIIFSH
EDGTRLGVEHLVALGHQQIALLAGPLSSVSARLRLAGWHKYLTRNQIQPIAEREGDWSA
MSGFQQTMQMLNEGIVPTAMLVANDQMALGAMRAITESGLRVGADISVVGYDDTEDSSC
YIPPLTTIKQDFRLLGQTSVDRLLQLSQGQAVKGNQLLPVSLVKRKTTLAPNTQTASPR
ALADSLMQLARQVSRLESGQ"