Note:
基本信息
- 载体名称:
- pCas-Guide-EF1a-GFP
- 载体抗性:
- Ampicillin
- 载体长度:
- 10493 bp
- 载体类型:
- CRISPR Plasmids
- 复制子:
- ori
- 载体来源:
- OriGene
- 拷贝数:
- High copy number
- 启动子:
- EF-1α
下载资源
我们所展示的质粒图谱主要是从文献和开放数据库中收集而来，主要是为了方便研究工作，其中一小部分质粒进行了质量控制，可供科学家使用。
确保质粒的关键元件正确，但是我们并不能保证实验效果。页面展示的图谱序列为理论序列，可能与测序结果不一致，请自行比对后确定是否满足要求。(如果测过序，本页面一般会提供下载)
开放数据库中的大多数载体序列都没有被完全测序。如果实际序列与参考序列的相似度超过99%，则将其视为正确。
由于科学研究是在探索未知，具有很大的不确定性，在任何情况下，我们都不承担超出质粒本身的额外经济损失或责任。
质粒操作方法
1. 发货形式：质粒干粉(常温运输，存于-20度，请务必先转化提质粒后使用)
2. 收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O溶解质粒;（质粒复测的浓度有时候与标称值差距较大，这可能是因为冻干质粒在管中的位置、复溶效率、测量偏差以及管壁的吸附导致，因此建议先转化提质粒后再使用）
3. 取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；
4. 加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min (30℃培养1-1.5小时);
5. 6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上;
6. 将平板倒置37℃培养14h，如果要求是30℃则培养20h; (菌落过多则将质粒稀释后再转化；没有菌落则加入10μl质粒转化；建议不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态);
7. 挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
pCas-Guide-EF1a-GFP 质粒 (编号: V012290)序列
LOCUS pCas-Guide-EF1a- 10493 bp DNA circular SYN 01-JAN-1980
DEFINITION Mammalian vector for co-expressing a guide RNA (gRNA) together with
Cas9 and TurboGFP, for genome editing using the S. pyogenes
CRISPR/Cas9 system.
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS pCas-Guide-EF1a-GFP
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 10493)
AUTHORS OriGene
TITLE Direct Submission
REFERENCE 2 (bases 1 to 10493)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
COMMENT SGRef: number: 1; type: "Journal Article"
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..10493
/mol_type="other DNA"
/organism="synthetic DNA construct"
promoter 90..330
/label=U6 promoter
/note="RNA polymerase III promoter for human U6 snRNA"
misc_RNA 384..459
/label=gRNA scaffold
/note="guide RNA scaffold for the Streptococcus pyogenes
CRISPR/Cas9 system"
terminator 460..465
/note="polIII terminator"
/note="RNA polymerase III transcription terminator"
promoter 480..1658
/label=EF-1-alpha promoter
/note="strong constitutive promoter for human elongation
factor EF-1-alpha"
CDS 1737..2432
/label=TurboGFP
/note="improved green fluorescent protein from Pontellina
plumata (Evdokimov et al., 2006)"
polyA_signal 2464..2917
/label=PGK poly(A) signal
/note="mouse phosphoglycerate kinase 1 polyadenylation
signal"
protein_bind 2944..2977
/label=loxP
/note="Cre-mediated recombination occurs in the 8-bp core
sequence (ATGTATGC) (Shaw et al., 2021)."
enhancer 3047..3350
/label=CMV enhancer
/note="human cytomegalovirus immediate early enhancer"
promoter 3351..3554
/label=CMV promoter
/note="human cytomegalovirus (CMV) immediate early
promoter"
promoter 3580..3598
/label=T7 promoter
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
CDS 3657..7760
/label=Cas9
/note="Cas9 (Csn1) endonuclease from the Streptococcus
pyogenes Type II CRISPR/Cas system"
CDS 7761..7781
/codon_start=1
/product="nuclear localization signal of SV40 large T
antigen"
/note="SV40 NLS"
/translation="PKKKRKV"
CDS 7788..7808
/label=SV40 NLS
/note="nuclear localization signal of SV40 (simian virus
40) large T antigen"
CDS 7830..7859
/label=Myc
/note="Myc (human c-Myc proto-oncogene) epitope tag"
CDS 7878..7901
/label=FLAG
/note="FLAG(R) epitope tag, followed by an enterokinase
cleavage site"
polyA_signal 7948..8570
/label=hGH poly(A) signal
/note="human growth hormone polyadenylation signal"
rep_origin complement(8691..9279)
/direction=LEFT
/label=ori
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
CDS complement(9457..10314)
/label=AmpR
/note="beta-lactamase"
primer_bind 10429..10445
/label=M13 rev
/note="common sequencing primer, one of multiple similar
variants"
promoter 10450..10468
/label=T7 promoter
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"