1 AAV简介
1.1 野生型AAV病毒
腺相关病毒（Adeno-associated viruse，AAV）载体是以AAV 基因组为骨架改造而来的基因递送工具。腺相关病毒属于细小病毒科的低致病性病毒，它的基因组为线性单链DNA，大小约 4.7 kB，在基因组两端分别有一条反向末端重复序列（Inverted terminal repeat，ITR），与病毒基因组高效释放、选择性复制和包装密切相关，基因组编码区有2个开放阅读框，分别编码4种Rep 蛋白和3种Cap 蛋白，它们分别在基因组复制、病毒装配以及包装中发挥着作用。
1.2 AAV载体的发现与发展
在 20 世纪 60 年代中期，腺相关病毒（AAV）首次被发现于实验室腺病毒制剂中，随后不久便在人体组织中被发现。AAV 研究的最初15-20年阐明了AAV 的几个重要方面，包括其基因组结构和组成、DNA 复制和转录、感染潜伏期和病毒组装。这些成就共同促进了将野生型 AAV2 序列成功克隆到质粒中，从而实现了遗传学研究和整个AAV2基因组的测序。这些早期研究为AAV 作为基因递送载体的应用提供了基础知识。自 AAV 载体问世以来，将其用作生物疗法也加深了我们对 AAV 转导途径中病毒与宿主相互作用的了解。
如今，重组 AAV（rAAV）已成为体内输送基因疗法的主要平台。2012 年，欧洲药品管理局批准了首个rAAV基因治疗产品 alipogene tiparvovec（Glybera），用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症（REF.24）；2017年，美国批准了首个rAAV基因治疗产品 voretigene neparvovec-rzyl（Luxturna）。
2 分类
AAV1：AAV1是最早被发现和应用的AAV血清型之一。它具有较高的递送效率和广泛的组织特异性，被广泛应用于心血管和肌肉系统的基因治疗。此外，AAV1还可以递送到中枢神经系统，并被用于治疗脊髓小脑共济失调、帕金森病和阿尔茨海默病等神经系统疾病。
AAV2：AAV2被广泛应用于肝脏、眼部和肺部等组织的基因治疗。AAV2是最早被应用于眼科基因治疗的AAV血清型，它能够稳定地递送基因到视网膜和葡萄膜等眼部组织中，并且具有较低的免疫原性。因此，AAV2被广泛应用于视网膜遗传性疾病的基因治疗，例如Leber遗传性视网膜病变（LCA）和视锥细胞萎缩症等。
AAV3：对于神经系统具有较高的递送效率，是神经系统相关疾病的潜在治疗载体。
AAV4：与AAV2相似，但其递送效率较低。
AAV5：对于肺部和肝脏等组织具有较高的递送效率，可用于治疗呼吸道和肝脏相关疾病。
AAV6：对于肌肉组织具有较高的递送效率。
AAV7：AAV7在肌肉组织和肝脏中具有较高的递送效率，并且能够穿过血脑屏障递送到中枢神经系统。
AAV8：对于肝脏和肌肉组织具有较高的递送效率，是目前广泛应用于肝脏相关基因疗法的载体。
AAV9：对于全身性递送和神经系统组织具有较高的递送效率，是近年来研究较为活跃的AAV载体之一。
AAV10：对于肝脏、心脏和肺部等组织具有较高的递送效率，可用于治疗相关疾病。
AAV11：与AAV2相似，但其递送效率较低。
AAV12：最近被发现的一种AAV血清型，对于肌肉和心脏组织具有较高的递送效率。
AAVrh10: AAVrh10是一种与猕猴相关的AAV血清型，具有较高的递送效率和广泛的组织特异性，尤其在心脏和肺部中递送基因的效果较为显著。此外，AAVrh10还可以递送到中枢神经系统和肌肉等组织中。
AAV2.7m8: AAV2.7m8是一种经过改造的AAV2血清型，具有更高的递送效率和更广泛的组织特异性。研究表明，AAV2.7m8可以在肝脏、心脏、肌肉、肺部和中枢神经系统等多种组织中高效地递送基因。
3 三质粒系统
3.1 表达载体（Expression vector）
包含了ITR序列、CMV启动子、多克隆位点等，用于携带外源基因。为了将野生型AAV变成适合体内基因递送的重组型AAV载体，研究人员对其进行了一系列的遗传改造。重组型AAV载体的病毒衣壳依然沿用野生型AAV的序列与构造，但是病毒衣壳内的基因组被完全剔除了Rep基因和Cap基因，仅仅保留有了负责引导病毒载体基因组复制和包装的ITRs序列。Rep基因和Cap基因的位置被需要递送的基因以及表达调控元件所替代，与野生型AAV相比，这种改造在很大程度上提高了AAV载体的装载量并极大降低了体内免疫原性和毒性。
3.2 包装质粒（Rep-Cap plasmid）
负责表达表达腺相关病毒的Rep和Cap基因，形成AAV病毒的结构蛋白，决定AAV的血清型和组织嗜性。
3.3 辅助质粒（pHelper plasmid）
由于野生型AAV是复制缺陷型的，必须依赖辅助病毒（如腺病毒）才可以感染靶细胞。AAV Helper Free Expression System利用在不同质粒上提供这些必要的辅助基因来确保重组AAV病毒具有感染性，消除AAV对辅助病毒的依赖，解决了AAV生产过程中要去除腺病毒污染的难题。
这样的设计允许利用多质粒瞬时转染系统大量制备科研或者临床级别的重组AAV载体产品。
4 转导途径
重组AAV载体的有效性在很大程度上取决于病毒衣壳和靶细胞表面受体分子之间的相互作用以及病毒粒子内吞后的下游转导。现有的血清型被认为可以识别糖蛋白等不同的细胞受体，因此AAV载体可以显示出不同的组织和细胞类型的靶向性，受体与共受体的组合识别模式也在重组AAV载体与细胞表面的结合和内化中发挥着重要作用。多种血清型的受体互作区域已经被确定，这为具有期望属性衣壳的合理性工程化改造提供了技术路线图。
AAV载体首先被宿主细胞表面的的糖基化受体识别，通过网格蛋白介导的内吞作用触发了病毒颗粒的内化，然后通过细胞骨架网络进行AAV载体的细胞质运输。由于内体中的pH值较低，VP1/VP2蛋白的结构与构象逐渐发生改变，在从内体逃逸之后，AAV颗粒通过核孔复合体进入细胞核并完成脱衣壳过程，部分AAV颗粒也可能被蛋白酶体降解失活。
目前使用的重组AAV载体的基因组包括单链AAV(ssAAV)和自主互补AAV(scAAV)两种类型。ssAAV里面包装有正义链或反义链基因组中的一种，这些单链形式的基因组在到达细胞核时仍然处于转录惰性的状态，转化为双链DNA是进行转录的先决条件。
双链DNA的形成可以通过宿主细胞DNA聚合酶进行第二链合成或通过可能共存于细胞核中的正负链进行退火来实现。因为scAAV在设计上已经是双链形式，因此它们可以立即进行转录。AAV基因组中存在的ITRs序列可以驱动分子间或分子内重组从而形成环状游离型基因组，这种形式的基因组可在细胞核内持续存在。
5 衣壳开发
5.1 自然发现（Natural discovery）
临床上最有希望的载体化血清型都是从天然产物中分离出来的。AAV2被发现于细胞培养污染物中，是最早被发现、且被描述和使用最多的血清型。AAV9是一种分支F血清型，凭借绕过血脑屏障的能力成为通过全身用药进入中枢神经系统的主要衣壳。肝脏和脾脏是人类和非人灵长类动物感染天然AAV的主要部位，AAV9便是从人类肝脏组织中分离出来的。
5.2 理性设计（Rational design）
第一种方法是嫁接能够与细胞类型特异性受体结合的多肽序列。将整合素结合肽序列引入衣壳表面可使 AAV2 重新靶向抗感染细胞。其他方法是将多肽序列融合到 VP2的氨基末端。另外，人们普遍认为，3-折叠突起在形成囊膜的靶向特性和免疫原性方面起着重要作用，因此 3-折叠突起的暴露位置是插入多肽以增强受体结合的理想位置。这种方法不仅能重新定位囊壳，还能阻止免疫识别。
第二种方法是扰乱细胞对衣壳的降解。研究表明，通过将表面暴露的酪氨酸残基进行定点突变，从而抑制蛋白酶体降解和促进细胞内转运，可使噬菌体在小鼠肝细胞内的转导效率提高近30倍。
5.3 定向进化（Directed evolution）
由于对 AAV 的细胞表面结合、内吞、运输、解衣壳和基因表达的了解仍不够充分，理性设计方案收到了限制。因此，从头开始的发现方法——定向进化策略，在许多情况下都是最佳的解决方案。定向进化的基础是模拟自然进化，在这种进化过程中，衣壳在选择压力下产生具有特定生物特性和优势特征（如组织特异性靶向、免疫逃逸和转基因表达）的基因变体。因此，衣壳文库的定向进化并不需要事先了解选择标准所涉及的分子机制。最近的许多研究还利用已有血清型的主序列随机生成嵌合衣壳（capsid shuffling）。结合易错PCR 技术，capsid shuffling法可通过检测更多具有固有不同靶向性的原有衣壳，获得更加多样化的衣壳文库。
随着下一代测序方法的出现，定向进化已成为发现新型载体外壳的一项更强大的技术。筛选数千个转基因的能力使我们能够反复富集可转导细胞或组织类型的候选基因。这些技术唯一的限制是，衣壳的进化需要在最能模拟目标组织的模型中进行。临床前 rAAV 的发现和验证基本都是在动物模型中进行的，然而这些动物模型既不能再现 AAV 对人类的靶向性，也不能再现治疗效果所需的载体效力。由于在人体内进化衣壳并不可行，人源化小鼠模型是这些研究的最佳替代物。例如，在Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-（FRG）小鼠中使用AdV5介导的病毒分离，并用原代人类肝细胞进行部分再填充，可以有效地鉴定出对人类肝细胞特异的囊壳载体。
5.4 计算机生物信息学方法（In silico bioinformatic approaches）
计算机提供了一种不需要完全了解AAV衣壳生物学的载体设计方法。例如，结合高通量测序，生物信息学工具可用于设计衣壳变体库，来确定可进行操作的高度可变区；通过对已知衣壳序列进行系统发育和统计建模，可推断出进化中间体、预测祖先衣壳序列。
6 生产
（1）获取目的基因
（2）构建AAV载体质粒及测序：将目的基因克隆至AAV载体
（3）载体质粒、辅助质粒和包装质粒共转染HEK293细胞
（4）收集AAV粗病毒：离心分别收集细胞上清和细胞沉淀，反复冻融
（5）浓缩纯化：PEG8000浓缩法/蔗糖密度梯度超速离心法
（6）质检：病毒滴度、质粒残留、宿主DNA残留、BSA残留、支原体检测、衣原体检测、内毒素检测、细菌及真菌检测等
7 功能
7.1 介导基因置换
基因置换指通过使用特定方法，将治疗性基因递送入指定细胞，利用染色体同源重组原理置换掉功能失常的基因。此技术适用于治疗隐性单基因遗传病，并取得了成功，例如 Luxturna，它是以 AAV2 为载体的基因治疗药物，通过眼部注射，递送 RPE65 基因表达框治疗由双等位基因突变引起的视网膜营养不良。
7.2 介导基因添加
基因添加。除了单基因疾病，rAAV介导的基因治疗有可能通过基因添加来解决复杂的遗传疾病和后天疾病，如心力衰竭和传染病等，例如为神经疾病提供神经营养因子，并调节心力衰竭的信号通路和癌症。其中一个重要策略为：使用rAAV递送编码重组抗体的基因，该抗体可以中和致命的病毒感染。这些手段利用肌肉内递送并将转导的肌肉细胞转化为生物工厂，以产生分泌到血液中的治疗性抗体。该策略目前正在进行HIV感染的临床试验。一个挑战是增强对载体抗体的免疫力，因为它们可以被识别为外来蛋白质。这种抗抗体反应会使循环抗体浓度低于预期，从而降低疗效。
7.3 介导基因编辑
利用基因编辑技术可以直接修复人体内潜在的疾病基因，它通常包括两个步骤：引起基因组靶向 DNA 断裂；进行 DNA 修复实现基因组改变。CRISPR-Cas9 是十分重要的基因编辑技术，能够通过向导 RNA 的设计，实现靶向基因组 DNA 位点的精确定位，并且设计简单，易操作，成为目前科学研究和临床应用的热点。 除此之外，AAV 载体也可以参与 DNA 修复过程，递送具有靶序列同源重组臂和治疗基因序列的基因组，最终通过与Cas9蛋白编码基因同时递送，实现基因治疗。
7.4 介导基因沉默
基因沉默技术主要用于治疗由获得毒性突变引起的单基因疾病。其中，由 AAV 载体介导的 CRISPR-Cas9 基因编辑技术单独使用也可以从 mRNA 水平实现高特异性的基因沉默。然而，RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术目前占据了 rAAV 基因沉默平台的主导地位，它是 mRNA水平调控的重要机制。shRNA 在用基因沉默技术时，存在基因沉默脱靶的可能。
尽管 AAV 载体药物在治疗某些罕见疾病方面取得了卓越的科学成就，但它的大规模临床使用和商业开发仍面临极大挑战。其中，由于目前 AAV 病毒包装系统仍未最优化，并且有限的基因表达效率增大了前期研究和临床治疗中病毒滴度的使用量，使基因治疗中 AAV 载体药物的价格十分高昂。实现 AAV 载体药物广泛使用需要调整治疗费用和增加患者普及率。相信在不久的将来，会有越来越多高安全性和兼备有效性的 AAV 药物在临床上市，服务于更多有需要的人群。
8 应用
8.1 眼部疾病
眼部（尤其是视网膜）是AAV基因疗法的理想场所。眼睛是一个相对"免疫豁免"的空间，即该组织环境可以耐受外源引入的抗原，而不产生炎症免疫反应，有利于外来移植物的长期稳定生存。给药安全性高，因为眼球属于小尺寸的器官，只能使用更小体积和数量的病毒。眼部局部治疗的可行性和可控性也使得基因疗法在这里更加可行和安全。例如，在眼底玻璃体手术中，可以直接将基因疗法载体注射到病变区域，避免了系统性给药带来的潜在不良反应。眼部解剖结构相对简单，相比于其他器官，眼睛的解剖结构相对简单，由少量的细胞类型构成。这使得基因疗法可以针对性地治疗特定的细胞类型或组织，同时也更容易监测治疗效果。眼睛非常适合进行光学检查，光学检查是眼科医生常用的检查方法之一。因此，基因疗法治疗后，可以通过光学检查来监测眼睛的结构和功能变化，为治疗效果的评估提供重要依据。眼睛的神经系统与中枢神经系统相连，但又是一个独立的单元，这使得研究人员可以利用眼睛作为对中枢神经系统的替代研究模型。例如，基因疗法治疗后，可以通过检查病人的眼底反应来判断治疗是否对大脑造成了潜在的影响。以下是AAV基因疗法在眼科疾病中的应用情况：
8.1.1 遗传性视网膜病变
遗传性视网膜病变是一类常见的视网膜疾病，常常导致视力障碍和失明。AAV基因疗法已经成功用于治疗多种遗传性视网膜病变，例如Leber遗传性视网膜病变、视网膜素蛋白缺乏症等。临床研究表明，AAV基因疗法可以显著改善患者的视力和生活质量。
8.1.2 黄斑变性
黄斑变性是老年性黄斑病变的一种，是导致视力丧失的主要原因之一。AAV基因疗法已经成功用于治疗一些黄斑变性患者，例如利用AAV2载体导入RPE65基因，以恢复视网膜色素的合成。临床试验结果显示，该治疗方案可以显著改善患者的视力和生活质量。
8.1.3 夜盲症
夜盲症是一类遗传性视网膜疾病，常常导致夜间视力障碍。AAV基因疗法已经成功用于治疗一些夜盲症患者，例如利用AAV2载体导入RPE65基因，以恢复视网膜色素的合成。临床试验结果显示，该治疗方案可以显著改善患者的夜间视力。
8.1.4 视网膜色素变性
视网膜色素变性是一类遗传性视网膜疾病，常常导致视力障碍和失明。AAV基因疗法已经成功用于治疗一些视网膜色素变性患者，例如利用AAV2载体导入BEST1基因，以恢复细胞膜通透性。临床试验结果显示，该治疗方案可以显著改善患者
8.1.5 免疫调节
AAV基因疗法还可以被用于调节免疫系统，例如治疗自体免疫性疾病、眼部过敏等。通过向免疫细胞输送调节基因，可以调节免疫系统的反应，从而缓解免疫反应引起的炎症和疾病。
8.1.6 新型治疗方法
AAV基因疗法还可以被用于开发新型治疗方法，例如治疗白内障、青光眼等。通过向受影响的细胞输送合适的基因或RNA，可以促进细胞的修复和再生，从而缓解或治愈眼部疾病。
8.2 神经系统疾病
目前用于体内递送至中枢神经系统的主要载体基于AAV，因为它们具有高效转基因递送的潜力、高度工程化的细胞靶向性、低毒性以及克服物理障碍的潜力，包括血脑屏障（BBB）。
8.2.1 帕金森病
PD是一种进行性神经退行性疾病，由黑质致密部（SNpc）的多巴胺能神经元死亡引起，导致多巴胺活性丧失，并导致异质性运动和非运动功能障碍。标准治疗药物包括给予左旋多巴（L-多巴），关键酶AADC随后将其转化为多巴胺。然而，由于神经元AADC活性的逐渐丧失，药物左旋多巴治疗无法持久地阻止PD症状的进展。递送编码AADC的转基因可以恢复多巴胺的生物合成。多项I期研究（NCT01973543、NCT03065192和NCT02418598）表明了通过实质内注射AAV2-AADC递送的安全性和耐受性。这些研究也取得了较好的临床结果，如AADC酶活性增加（高达79%）、抗帕金森病的减少（高达42%）和较高的衣壳覆盖率（高达42%）。
8.2.2溶酶体贮积症（LSD）
LSD是一组70多种遗传性疾病，其特征是各种生物分子（包括聚糖和脂质）分解代谢所需的溶酶体酶缺乏，这导致未降解物质的细胞积累和进行性神经退行性病变。LSDs患者的常规治疗包括造血干细胞移植和酶替代治疗（ERT）。然而，ERT校正在中枢神经系统疾病中一直是一个挑战，因为静脉注射的酶不能穿过血脑屏障，因此，基因治疗提供了一种有前景的、潜在的一次性治疗方法来纠正酶的缺乏。
8.2.3脊髓性肌萎缩症（SMA）
SMA 1型是一种常染色体隐性神经肌肉疾病，其特征是由存活运动神经元1（SMN1）基因的破坏引起的脊髓α运动神经元的逐渐减少，患者的中位生存期只有10个月。基于AAV的基因疗法旨在恢复SMN1的表达，从而挽救运动功能。AAV9在静脉注射后显示出一定的通过血脑屏障进入中枢神经系统的能力，临床前研究表明，静脉注射编码hSMN的AAV9治疗SMA有很大的前景。
8.2.4脊髓小脑共济失调（SCA）
SCA是一个由40多种神经退行性疾病组成的异质性群体，其特征是失衡、协调性丧失和言语困难。SCA主要由三核苷酸重复扩增引起，或者较不常见的是由特定基因的点突变引起。该疾病主要为常染色体显性遗传，可通过使用siRNA或人工miRNA使显性基因沉默来治疗。对小鼠的研究表明，使用单剂量编码shRNA的AAV诱导RNAi并将其递送至中枢神经系统，抑制突变等位基因可以减缓小脑变性，改善运动表型，并预防/逆转疾病症状。
8.3 血友病
血友病（Hemophilia），是一类由于血液中某些凝血因子的缺乏而导致患者产生严重凝血障碍的遗传性出血性疾病，可分为血友病A型、血友病B型和血友病C型，病因分别为凝血因子Ⅷ、Ⅸ或Ⅺ的缺乏，前两者为伴X染色体隐性遗传病，后者为常染色体不完全隐性遗传。血友病中A型血友病最为常见，约85%血友病患者为A型，B型次之，C型较为罕见。
对于血友病患者来说，基因治疗几乎是唯一的有效治疗方法。通过基因治疗将凝血因子Ⅷ安全递送到患者细胞中，让其长期稳定表达，并使用极可能低的载体剂量，来改善患者的出血情况和凝血功能，是研究人员的最终目标。
在一项1-2期临床试验中，研究团队为18名A型血友病患者进行了以AAV5为载体的SPK-8011疗法，结果表明，接受治疗的18名A型血友病患者中有 16人成功持续表达凝血因子Ⅷ，并显著减少出血事件，且没有报告重大安全问题。
9 安全性
AAV病毒携带的治疗性基因片段有些被整合到了染色体上控制生长的基因附近，有诱发癌症的可能性。此外，最新研究发现，高剂量的AAV存在较严重的毒性，包括转氨酶升高、背根神经节退化、遗传缺陷和共济失调等。相比于其他治疗方案，应用AAV疗法时患者仍处于婴儿期，因此该方案的安全性值得高度重视。
Souce: 纽普生物 2023-08-18