纽普生物

慢病毒、逆转录病毒及病毒包装(第二代/第三代)

慢病毒是逆转录病毒科下面的一个属,之所以成为慢病毒,是因为这些病毒具有长达数年的潜伏期,其中人HIV,猴SIV,猫FIV都是慢病毒。

逆转录病毒至少包含三种基因:

gag包含组成病毒中心和结构的蛋白质的基因(Gag, group specific antigen)

pol包含逆转录酶的基因(Pol, polymerase)

env包含组成病毒外壳的基因(envelope)

逆转录病毒可以分为三类:致瘤病毒(导致癌症);慢病毒(导致慢性病);泡沫病毒(不导致疾病)。

Gag形成病毒核心,pol编码各种RNA相关酶,env编码外壳蛋白。

Proteins encoded by the HIV genome

分类

基因名

初级蛋白产物

成熟蛋白产物

病毒结构蛋白

gag

Gag多聚蛋白

MA, CA, SP1, NC, SP2, P6

pol

Pol 多聚蛋白

RT, RNase H, IN, PR

env

gp160

gp120, gp41

必要的调控元件

tat

Tat


rev

Rev


其他调控蛋白

nef

Nef


vpr

Vpr


vif

Vif


vpu

Vpu


 Env:编码Env蛋白。该蛋白包括包膜糖蛋白前体gp160、包膜糖蛋白gp120gp41gp160在蛋白酶作用下分解为gp120gp41两种包膜糖蛋白。gpl20暴露于病毒包膜之外称外膜蛋白,感染细胞时可与细胞的CD4受体蛋白结合;gp41称跨膜蛋白,镶嵌于病毒包膜脂质中。

RT:逆转录酶

RNase HRNA

IN:整合酶

PR:蛋白酶

Tat:调节病毒RNA基因组的反转录,确保有效的合成mRNA,并调节细胞释放病毒颗粒,是HIV-1复制所必需的转录激活因子。Tat蛋白是一种反式激活因子,与LTR上的应答元件结合后能启动及促进病毒基因的mRNA 转录。

Rev:调节病毒蛋白的表达,RevHIV-1复制所必需的,缺少Rev功能的前病毒具有转录活性,但不能表达晚期基因,不能产生病毒粒子。

LTR:长末端重复序列(LTR),反转录病毒的基因组的两端各有一个长末端重复序列(5' LTR3' LTR),不编码蛋白质,但含有启动子,增强子等调控元件。病毒利用LTR将基因组整合到宿主基因组中。

顺式作用元件(cis-acting element),位于基因的旁侧,可以调控影响基因表达的核酸序列。包括启动子(promoter 、增强子(enhancer)、应答元件(responsive elements)等。其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因。其本身并不编码蛋白质,可以与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。

反式作用因子(英语:Trans-acting factor),是参与调控基因转录效率的蛋白质因子,可以直接或间接识别或者结合顺式作用元件核心序列,可对基因表达产生激活或阻遏的作用。

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反转录转座子(retrotransposon),简称“反座子”(retroposon),是由RNA介导转座的转座子的元件,在结构和复制上与反转录病毒(retrovirus)类似,只是没有病毒感染必须的env基因,它通过转录合成mRNA,再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座,每转座1次拷贝数就会增加1份,可以增强自己的基因组。因此,它是许多真核生物中数量最大的一类可活动遗传成分。在植物中特别丰富,它们是核DNA的一个主要组成部分。

反转录转座子可以分成两大类:

一类是LTR反转录转座子,是具有长末端重复序列(long terminal repeatsLTR)的转座子,这也是反转录病毒基因组的特征性结构,这类反转录转座子可以编码反转录酶(Reverse transcripatase)或整合酶(integrases)

另一类是非LTR反转录转座子。

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RCRreplication-competent recombinant,产生有复制能力的反转录病毒。

第一代HIV-1来源的慢病毒载体:

第一代慢病毒载体系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。


第二代HIV-1来源的慢病毒载体。在第一代的包装质粒上剔除一些反式作用因子,所以还是三质粒组成。

载体质粒:插入我们的目的片段。插入的目的片段两侧有LTR,有助于整合到宿主基因组上。

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第三代HIV-1来源的慢病毒载体,在第二代的包装质粒基础上,将gagpol分散到两个质粒上,这样第三代系统由4个质粒组成。

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2nd vs 3rd   Generation Lentiviral Systems 

Feature

2nd Generation

3rd Generation

Transfer Plasmid

Can be packaged ONLY by a second generation packaging   system that includes TAT

Can be packaged by both 2nd and 3rd generation   packaging systems

Packaging Plasmid

All on one plasmid: Gag, Pol, Rev, Tat

Two plasmids: one encoding Gag and Pol and another   encoding Rev

Envelope Plasmid

Interchangeable: usually encodes for VSV-G

Interchangeable: usually encodes for VSV-G

Safety

Safe. Replication incompetent: Uses 3 separate plasmids   encoding various HIV genes.

Safer. Replication incompetent and always SIN: Uses 4   plasmids instead of 3 and eliminates the requirement for Tat.

LTR Viral Promoter

Wild type

Hybrid: 5'LTR is partially deleted and fused to a   heterologous enhancer/promoter such as CMV or RSV

 

病毒制备:

将三个/四个质粒一起感染细胞,培养一段时间后收集上清中的病毒。

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Souce: 纽普生物    2017-07-05