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常用蛋白酶酶切位点及融合标签去除策略

目前主要通过4种方法移除多肽标签,即化学法、内切蛋白酶法、外切蛋白酶法以及基于内含肽的自我剪切法.

  1. 化学法

    最常用的便是溴化氰(CNBr)法,原理是CNBr能断裂甲硫氨酸和下游氨基酸残基之间的肽键(Met-X, X为任意氨基酸)。化学法具有效率高、耗时短、成本低等优点。化学法也有很多不足,例如化学法所需的反应条件容易破坏目标蛋白的结构和功能,而且所使用的溴化氰等试剂具有毒性,不适合药用蛋白的处理及研究。化学法使用的溴化氰能够使蛋白质在甲氨酸残基处断裂,如果目标蛋白含有内源甲氨酸残基,会发生非特异性断裂,导致降解和破坏目标蛋白。而且化学法切割时容易产生副反应,会对修饰一些氨基酸侧链而改变目标蛋白的特性。这些缺点限制了化学法在移除多肽融合标签时更为广泛的应用。

  2. 内切蛋白酶法

    常用的内切蛋白酶及识别的位点如下:

    蛋白酶识别位点其他特征
    Thrombin
    Leu-Val-Pro-Arg↓Gly-Ser (LVPRG↓S)
    切割效率与二级结构有关
    Factor Xa
    Ile-Glu/Asp-Gly-Arg↓ (IE/DG↓R)
    切割效率与GR附近的二级结构有关
    Enterokinase
    Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓(DDDDK↓)
    切割效率与二级结构有关
    TEV protease
    Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly(ENLYFQ↓G)

    PreScission
    Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro(LEVLFQ↓GP)

    HRV 3C Protease
    Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro(LEVLFQ↓GP)

    SUMO Protease
    识别SUMO的三维结构

    内切蛋白酶的特异性和酶切效率主要受3种因素影响。第一种因素是内切蛋白酶固有的非特异性酶切。有些内切蛋白酶如FactorXa和凝血酶存在着第二切割位点,而且随着反应条件的不同其第二位点的切割效率也是变化的。非特异性切割可以通过控制反应条件减少,但不能完全消除,因此需要优化条件减少非特异位点切割,并且需要检测切割后的产物,以确定目标蛋白产物的均一性。第二种因素是目标蛋白的结构。由于蛋白质肽链的空间折叠,有些融合蛋白的酶切识别位点位于蛋白质结构内部,内切蛋白酶活性中心难以接触到识别位点,导致酶切效率低下。例如利用肠激酶对处于聚集状态的目标蛋白所含的多聚组氨酸标签的切除研究证实,只有使目标蛋白结构发生一定的变化,暴露出肠激酶的切割识别位点,才能很好地达到标签切除的目的。第三种因素是溶液中化学成分如去垢剂的影响。在纯化一些疏水性蛋白和跨膜蛋白时,需要加入去垢剂,有可能会影响内切蛋白酶活性而降低酶切效率。例如去垢剂在低浓度范围内对TEVprotease酶切效率影响不明显,但是达到一定浓度后会明显抑制酶活性。

  3. 外切蛋白酶法

    外切蛋白酶的种类包括氨基肽酶和羧肽酶,分别可以用来切除位于目标蛋白N端和C端的融合标签,例如氨基肽酶M(aminopeptidaseM,APM)和羧肽酶A和B(carboxypeptidaseA和B,CPA和CPB)等。

    在利用外切蛋白酶法移除融合标签的系统中,最有代表性的是QIAGEN公司基于二肽氨基肽酶I(dipeptidylaminopeptidase I,DPPI,商业名称为DAPase)的作用机理所提供的TAGZyme系统,用于移除N端的多聚组氨酸标签。DAPase能够从蛋白质N端依次切除二肽,切除反应的终止位点为N端出现Lys、Arg、Gln残基,或者在N端第2个或第3个氨基酸残基是Pro。如果目标蛋白在N端具有天然的DAPase切除终止位点,可以直接设计利于DAPase切除的融合标签,构建相应重组蛋白质。

  4. 内含肽

    内含肽(intein)是前体蛋白中的一段插入序列,能够自我催化蛋白质的剪接(protein splicing),使自身从前体蛋白中切除,并将两侧外显肽(extein)连接形成成熟蛋白。目前已经发现超过450个以上的内含肽,分布于真核生物、真细菌和古细菌、病毒和噬菌体。

    相比于化学法,自我剪切法条件温和,不会使目标蛋白损伤变性。相比于酶切法,自我剪切法简化了纯化过程,节约了成本和时间。传统的酶切法需要多次过柱和多步纯化,以分离融合蛋白和除去蛋白酶及融合标签。而自我剪切法能够免除酶的消耗及过柱所产生的昂贵费用。

    自我剪切法也存在一些缺点,例如外显肽靠近内含肽的残基能够影响自我剪切效率。对于某些蛋白质,需要在目标蛋白与内含肽的接头端引入氨基酸残基提高剪切效率,从而会给目标蛋白产物带来多余的氨基酸残基。

    自我剪切法的诱导条件也不易控制,融合蛋白可能会在表达过程中发生体内诱导的提前剪切导致纯化失败,而且有些自我剪切的诱导剂如巯基试剂会影响目标蛋白的二硫键及相应结构。

Souce: 纽普生物    2017-06-01