双特异性抗体种类、特点及其制备技术

双特异性抗体是一类可以同时特异结合2个不同抗原的双功能的抗体分子。目前,至少有30 多种双特异性抗体药物处于临床研究阶段。

双特异性抗体在自然状态下不存在,只能通过人工制备,经过多年的研究及技术发展,双特异性抗体在结构上出现了许多不同的设计策略。按照其是否含有Fc 功能区,主要分为2 : 含有Fc 区的双特异性抗体和不含Fc 区的双特异性抗体。

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1.1    含有Fc 区的双特异性抗体

抗体的Fc结构域的生物学功能有:抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体介导的细胞毒作用(CDC)。双特异性抗体的制备技术手段有以下几种:

TriomabsTriomabs 通 过Fv 功能区分别结合肿瘤细胞及T 细胞,通过Fc 功能区募集表达FcR的功能细胞,如NK  细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞及树突状细胞等,形成复合体,刺激T 细胞分泌细胞因子清除肿瘤细胞,因此Triomabs  又被称为三功能抗体。Triomabs 双特异性抗体技术平台由德国Fresenius和Trion Pharma 公司合作开发。

Knobs-into-holes这项技术由Genentech公司开发。具体方法是将其中一个抗体的重链CH3366 位体积较小的苏氨酸( T) 突变为体积较大的酪氨酸( Y) ,形成突出的“Knobs”型结构( T366Y) ; 同时将另一个抗体重链CH3 407 位较大的酪氨酸( Y) 残基突变成较小的苏氨酸( T) ,形成凹陷的“holes”型结构( Y407T) ; 利用“Knobs-into-holes”结构的空间位阻效应实现两种不同抗体重链间的正确装配。突变后,产品正确装配率由野生型的57% 提高至92%,能够满足规模化生产的要求。但重链CH3 的这一改构方式降低了抗体结构的稳定性,为了克服这一缺点,研究者通过噬菌体展示技术进行随机突变筛选,构建了更为稳定的“3 + 1”模式Knobs-holes结构: T366W 突变形成突出的“Knobs”型,3 个氨基酸突变( T366SL368A Y407V) 形成凹陷的“holes”型。Knobs-holes结构设计有利于2 种异源抗体重链的装配。

Crossmab: Crossmab 技术的代表产品为罗氏公司的RG7221 RG7716,两者均为抗Ang-2 /VEGF 双特异性抗体。其结构是在“knobs-holes”结构基础上通过链交换技术,将Ang-2 抗体Fab结构域中的CL CH1 互换,而VEGF 抗体的Fab结构则保持不变。经过改造的Ang-2 抗体轻链不易与血管内皮生长因子( VEGF) 抗体的重链发生错配,同时“knobs-holes”结构可促进两条重链异源二聚化。

Ortho-Fab: 该技术是Lewis 等报道的一种克服轻链错配的设计策略。Lewis 等通过计算机模型化并结合X 晶体衍射技术对VH/VLCH1 /CL 进行正交互补突变设计,从而减少轻链错配现象,将此技术结合重链异源二聚化方法,可以实现双特异性抗体在单一细胞内的高效表达。近期,静电转向技术( electrostatic steering) 也被应用进行Orthogonal Fab 双特异性抗体的构建。

DVD-Ig是另一种保留抗体Fc 结构域的设计,其结构是在正常抗体轻、重链的N 末端分别再接入另一个抗体的VL VH,通过2 个抗体可变区结合双靶点实现双功能。这类分子与现有抗体具有相同的Fc 区,因此可以采用现有通用抗体技术进行生产。

Two-in-one该技术最早由Genentech 公司Bostrom 等提出,其采用噬菌体展示技术,将与HER2 靶点特异性结合的商业化抗体Herceptin 进行优化,使其能与VEGF特异性结合,同时保留与HER2 的结合能力,从而实现了一个抗体同时结合两个靶点,因此称为Two-in-one双特异性抗体,又称为DAF 抗体( Dual Action FabDAF)Two-in-one 双特异性抗体完全保持了正常IgG 抗体的结构,稳定性良好,而且可以应用常规抗体表达生产技术进行产业化生产,其在下游生产工艺、制剂开发和体内药动学等方面具有突出的优势。

IgG-scFv scFv2-FcIgG-scFv双特异性抗体是将单链抗体( scFv) 连接在正常IgG 抗体分子的C 末端,通过分子两端的CDR区与靶分子结合实现双功能。而scFv2-Fc 分子与IgG-scFv 结构类似,是将两个scFv 分子分别连接在Fc 功能区的两端,形成双功能区。

1.2    不含Fc 区的双特异性抗体

另一类双特异性抗体不含Fc 区,其优点是相对分子质量小、可以在原核细胞中表达且更易穿过组织及肿瘤细胞到达靶位点; 缺点是由于不含抗体Fc区,不能介导相应的生物学功能且半衰期通常较短,如已上市的Blinatumomab 血液半衰期只有2.11 h,需要通过注射泵连续给药28 d。目前,此类双特异性抗体主要有BiTEDARTTandAbs bi-Nanobody 等。

BiTE 双特异性抗体:德国Micromet 公司开发的BiTE系列产品是不含Fc 区结构类双特异性抗体的典型代表。BiTE 是将抗CD3 单链抗体( scFv) 与不同抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体通过肽段进行连接而获得,可同时结合CD3 阳性T 细胞及肿瘤细胞。BiTE 通过结合T 细胞表面CD3,将T 细胞募集至肿瘤细胞表面,从而激活T 细胞进行肿瘤杀伤。BiTE 技术研究者克服了scFv 稳定性差、表达量低、溶解性低等生产问题,成功实现了BiTE 产品的商业化。

DART 双特异性抗体:DART是由MacroGenics 公司和Servier公司联合开发的新一代双特异性抗体构建技术。DART 双特异性抗体是由两条多肽链结合形成的异源二聚体抗体,其结构是将一个抗体可变区的VHVL 序列分别与另一个抗体可变区的VL VH序列连接形成。此外,在两条多肽链的C 末端引入了半胱氨酸,通过半胱氨酸形成链间二硫键,提高产品的稳定性。

TandAbs 双特异性抗体: Affimed 公司开发的TandAbs 双特异性抗体是四价的抗体分子,针对两个抗原各有2 个结合位点。TandAbs 结构为Fv1-Fv2-Fv2-Fv1,是由两分子肽链反向配对形成的同源二聚体分子。TandAbs 相对分子质量约为110 kD,介于全分子抗体及BiTE 之间( 50kD) ,产品半衰期可达23 h; 同时蛋白无糖基化修饰,产品更为均一,免疫原性低。

bi-Nanobody 双特异性抗体:NanobodyAblynx 公司参考骆驼及美洲驼的单域抗体结构( 无轻链及CH1 ) ,通过结构简化,仅保留VH 区而开发的专利平台技术。在实际应用中,Nanobody 是将2 个或多个抗体分子的VH 区进行连接而实现多特异性结合。该类产品的主要优点是分子小、稳定性高、易于人源化、易于连接,并可通过多种途径进行给药。此外,在分子设计时可选择加入与人血白蛋白结合的功能区,将半衰期延长至2 3 周,并且可以通过白蛋白将药物运输至靶位点。

Souce: 纽普生物    2016-09-08