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蓝白斑筛选

今天我们讲讲一种很经典的重组子筛选技术——蓝白斑筛选。

先介绍下两种非常常用的蓝白斑筛选质粒pUC18pUC19

背景:细菌的乳糖操纵子(lac)包含一个叫lacZ的基因,它编码的蛋白是β-半乳糖苷酶。乳糖操纵子可以被乳糖或者乳糖类似物IPTG给激活,启动下游基因的表达。(严格的来说,IPTG是与lac阻遏物结合,让它失活来启动lac的表达的)。β-半乳糖苷酶可以降解一种连接有染料的底物(X-gal5--4--3-吲哚-β-D-半乳糖苷),生成半乳糖和一种不溶于水的蓝色色素。

蓝白斑筛选试验

科学家发现,lacZ基因删掉一段(删掉后的突变体命名为lacZΔM15)后编码的突变体β-半乳糖苷酶是没有功能的,当被删掉的一段(命名为α-肽)与lacZΔM15同时在一个细胞内表达的时候,他们可以组合重新恢复功能。这个过程叫α-互补。

根据这个特性,科学家在α-肽的氨基酸加了一个多克隆位点(MCS),如下图左边的黄色楔形。将改造过的α-DNA编码片段插入到质粒中,构建了α-克隆载体。当目的基因插入到多克隆位点中,α-肽就变成下图A细胞中所示,不能与细胞的β-半乳糖苷酶突变体结合恢复功能。而如果没有基因插入多克隆位点,也就是空载情况下,α-肽能与细胞中的β-半乳糖苷酶突变体互补而恢复功能(如细胞B所示)。

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如下图所示,是一个典型的蓝白斑筛选平板。如果有DNA插入,那么会产生一个没有功能的β-半乳糖苷酶,形成白斑。而如果没有基因插入,即空载情况,会形成α-互补,从而形成蓝斑。值得注意的是,准备这块平板的时候记得要加入IPTGX-gal底物。

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蓝白斑筛选的注意事项

对照:用空载体转化平板,板子上的所有克隆应该都是蓝色。证明IPTGX-gal都没有问题。

培养时间:一般平板要在培养箱中至少培养16-20小时才可以让细菌表达出β-半乳糖苷酶,从而菌落才能变色。如果平板上的所有克隆子都是白色,这往往是不正常的。

将平板放冰箱冷藏:平台在培养箱过夜培养后放在冰箱中冷藏一会,利于不溶的色素沉淀,从而可以更好的与蓝色菌落区分开。

制作平板的时候要注意:X-gal对光和温度非常敏感,需要在培养基灭菌后再加入。

假阳性:蓝白斑筛选只能证明有DNA插入到MCS,而不能证明插入的就是你的目的DNA片段。

假阴性:这种情况比较罕见,如果插入的片段较小,同时造成通读,而且能与细胞中突变的β-半乳糖苷酶互补。

宿主细胞:宿主细胞得是lacZΔM15基因型的,如XL1-Blue, DH5α, DH10B, JM109, STBL4, JM110, Top10

质粒载体:需要含有α-互补克隆的MCS,如pGEM-T, pUC18 and pUC19pBluescript

Souce: 纽普生物    2016-07-22