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质粒载体与转录终止子和polyA

用于基因表达的质粒载体根据载体上的功能元件,可以划分为两类:原核的和真核的。无论是原核系统还是真核系统,质粒DNA 都必须转录成RNA,这个过程可以划分为三步:1.起始,2.延伸,3.终止。本文我们主要讨论转录的终止。

什么是转录终止和聚腺苷酸化?

转录终止子(序列决定)界定了一个转录单元的结束(比如说基因)和新合成的RNA从转录机器上释放过程的开始。转录终止子位于基因的下游,通常紧跟着poly(A)位点后面。许多研究集中在启动子的强度跟基因的表达水平的关系,而事实上,转录终止子影响RNA加工过程和半衰期,从而影响基因的表达。聚腺苷酸化,顾名思义,就是在信使RNA的的末尾加上多个腺苷酸(A)的一种转录后修饰。聚腺苷酸化的作用和机制在不同的细胞类型中有所不同,但是一般认为在真核细胞中聚腺苷酸化可以帮助延长转录本的寿命,免受核算外切酶的降解,而在原核细胞中则加快转录本的降解。

原核细胞的转录终止子

原核的转录终止子分为两类:一种是依赖ρRho)因子的,一种是不依赖的。Ρ因子是一种解旋酶,能够辅助RNA聚合酶的转录终止。Ρ因子依赖的转录终止子一般很少用于基于质粒的表达系统,所以我们不做过多探讨。

几乎所有常用的细胞表达质粒都是用的非ρ因子依赖的转录终止子,包括T7rrnB以及T0。非依赖ρ因子的转录终止子是一种固有的强终止子。DNA上含有终止序列的特殊位点,即模板链上有富含GC的回文结构,由于GC之间是3个氢键,较稳定,因而当RNA聚合酶经过时不会拆开 DNA形成的茎环结构,前行受到阻止.模板链上随后有多个连续的A,RNA上转录成多个U,AU配对氢键弱,因而RNA易于DNA分离,重新形成DNA 双螺旋,RNA脱离。

下图是一个典型的非依赖ρ因子的转录终止子的结构示意图

说明: Rho Independent Terminator

没有转录终止子的终止效率可以达到100%,一些改造过的强终止子可以达到很高的终止水平(>95%)。对于绝大部分应用,任意一种终止子都足够满足要求。许多商业化的载体用了双终止子来减少下游的转录和翻译。

原核细胞的聚腺苷酸化

聚腺苷酸化一般认为是真核细胞特有的加工过程,但是原核细胞中它也会在RNA产物的末尾加上聚腺苷酸。与真核细胞不同的是,在真核细胞中poly(A)通常加在特定的poly(A)信号位点处,而在原核细胞中这个位点不是特异的,比较随机。poly(A)尾巴会加快RNA的降解,这一点与真核细胞也是不同的。由于加poly(A)尾没有特异性,所以poly(A)尾通常被认为是用来调节细胞内的RNA浓度水平,并作为一种质量控制机制来清楚错误折叠的RNA

真核细胞的转录终止和聚腺苷酸化

与原核细胞中只有一种RNA聚合酶不同,真核细胞中有三种RNA聚合酶,分别是RNA聚合酶I,II,III。每种RNA聚合酶转录出不同类型的RNA:聚合酶I用于转录核糖体RNA,聚合酶II用于转录mRNAmiRNA而聚合酶III则转录出tRNA和其他的小RNA。尽管没有原核的转录终止机制研究的那么透,真核的基本转录终止过程还是清楚的。每种RNA聚合酶的转录终止都是不同的。比方说,聚合酶III依赖于特定的序列和RNA二级结构来诱发RNA的剪切,与原核中的ρ因子依赖的转录终止过程有点类似。而聚合酶I和聚合酶II则不同,它们都需要终止因子的参与才能完成终止过程。尽管都需要终止因子的参与,聚合酶I和聚合酶II的的转录终止机制也是不同的。聚合酶I用的机制跟ρ因子依赖的转录终止过程类似。而聚合酶II的机制则复杂的多,它需要两个RNA聚合酶相关蛋白的参与(CPSF CstF),这两个蛋白复杂招募剪切和聚腺苷酸化的酶(转录终止和加poly(A)协同进行)。

哺乳动物细胞表达质粒主要是用于转录出mRNA 常用的转录终止子有SV40, hGH, BGH, rbGlob,同时包含有AAUAAA基序促进聚腺苷酸化和转录终止。除了上面列出的,SV40 late polyA rbGlob polyA被认为可以更加有效的终止转录。

如上面所述,聚合酶II的转录本(mRNA)的转录终止和poly(A)是协同过程。如下图所示,CPSF CstF招募的酶一边在CA位置进行切割,从RNA聚合酶上释放出mRNA,同时在自由的3’末端加上polyA尾巴。加上polyA后,RNA变得更加稳定,对mRNA出核和翻译都是必须的。

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有一点特别需要注意的是,哺乳动物细胞的poly(A)信号和病毒包装系统的联合使用可能会降低病毒滴度,延长转录本的寿命,所以处理的时候需要谨慎一点。因为这个原因,病毒载体通常会使用其他非poly(A)的转录本稳定元件和出核元件,如WPRECTE或者使用其他弱的poly(A)信号,如BGH


Souce: 纽普生物    2016-07-20