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如何提高昆虫杆状病毒表达系统重组蛋白表达水平?

利用转基因动物(包括绵羊,山羊,猪,大鼠,奶牛等) 生产各种重组蛋白和工程疫苗是近年来的热点之一。但是,转基因动物研究过程中存在许多问题,例如生产重组蛋白所需时间长、生产量过低等。相对而言,昆虫细胞表达系统(包括杆状病毒表达系统和稳定转化细胞系统)所需时间较短,效率更高,特别是昆虫杆状病毒表达系统已被广泛地应用于高等真核生物蛋白的生产,它是利用携带有外源目的基因的重组病毒做载体在昆虫体内或培养细胞内进行表达的一个生产系统。因为昆虫细胞与哺乳动物细胞翻译和翻译后蛋白修饰的模式与能力相似,包括糖基化、磷酸化和蛋白其他后加工等。在杆状病毒表达系统中,培养的细胞和昆虫幼虫或蛹都可用于重组蛋白的生产,多数情况下,重组蛋白被加工、修饰并运送到细胞中合适的位置,获得所期望的生物学活性。

在传统的杆状病毒表达系统中为了构建重组杆状病毒,必须用杆状病毒和转移质粒转染培养细胞,并且获得的病毒滴度较低。为了改善传统昆虫杆状病毒的重组效率低,耗时长且麻烦的的缺点,Luckow等成功开发了一种快速、高效产生重组AcMNPV 病毒的技术。即利用细菌转座子原理,在大肠杆菌内就能完成重组病毒的构建,取名为Bac-to-Bac 表达系统,意即从细菌(bacterium)到杆状病毒(baculovirus),革命性地改变了重组昆虫杆状病毒地构建方法。

虽然昆虫杆状病毒表达系统已经成功表达了上千种重组蛋白,但由于各种原因目的蛋白的产量通常很难达到较高的水平。虽然多角体启动子非常强大,但驱动外源基因时往往远低于野生病毒多角体蛋白的生产效率。随着时代的发展,人类对各种有用蛋白的需求越来越大,重组蛋白的应用范围更加广泛,包括蛋白质的生物学研究、工程疫苗、医用蛋白等,这就要求杆状病毒表达系统更加完善,关键技术上不断改进,外源蛋白的表达量进一步提高。

1 抑制蛋白降解提高重组蛋白表达水平

利用BEVS 表达的重组蛋白,常因存在着蛋白质降解而导致其产量下降的问题。这是因为BEVS是一个裂解性的系统,在病毒感染和表达过程中,病毒本身也表达出蛋白酶,特别是半胱氨酸蛋白酶vcath,会对重组目的蛋白进行降解。在BmNPV 和AcNPV 基因组中,均有半胱氨酸蛋白酶基因,该基因位于病毒基因组第127 个阅读框架,由323 个氨基酸组成。由于半胱氨酸相互结合而形成的二硫键在蛋白质的高级结构中发挥着极为重要的作用,因此保护半胱氨酸不受降解是非常重要的。

Suzuki 等在BmNPV 基因组中用β-半乳糖苷酶基因融合hsp70 启动子来取代半胱氨酸蛋白酶,获得萤火虫荧光素酶的高效表达。Richard 等人从AcMNPV 基因组中删除半胱氨酸组织蛋白酶和几丁质酶基因,增强分泌的重组蛋白稳定性。这些改造主要有利于重组蛋白通过细胞分泌途径的转移,防止蛋白一旦被释放于培养体系中就被降解。在此基础上他们又删除了病毒基因P26、P10 和P74 基因,结果发现报告基因β-半乳糖苷酶(β-gal)和绿色荧光蛋白(EGFP)的表达水平显著提高。Hiyoshi 等在BmNPV 基因组中删除半胱氨酸蛋白酶基因,获得GFPuv-β1,3-N-乙酰葡糖胺转移酶2(β3GnT2)融合蛋白(GGT2)的高效表达。与传统BmNPV 获得的蛋白酶活性相比,删除几丁质酶基因的BmNPV 所感染家蚕幼虫的蛋白酶活性降低了85%,GGT2 降解也有所降低,β3GnT 活性改善了30%。此外,Park 指出同时删除几丁质酶与半胱氨酸蛋白酶基因的BmNPV中β3GnT 活性要比未改造的BmNPV 高2.8 倍。Ishikiriyama 等人用删除几丁质酶基因和删除几丁质酶与半胱氨酸蛋白酶基因的BmNPV 在血淋巴中高效表达人类抗牛血清清蛋白(BSA)单链Fv(scFv)片段,比用未改造的BmNPV 高3.8~4.3 倍,因为Bm-NPV 半胱氨酸蛋白酶所引起降解受到了明显抑制。蛋白降解一直以来是影响蛋白表达水平的主要问题,虽然是BEVS 系统自身固有的问题,但并非不能解决。通过改造杆状病毒基因组,删除导致重组蛋白降解的蛋白酶基因,减轻和降低重组蛋白的降解,保证了外源基因表达产物的稳定,有效提高了BEVS系统的表达效率。

2 合理调控目的基因的转录

根据目前的研究,BEVS 中多角体启动子控制下外源基因的表达水平通常远不如多角体蛋白的表达水平。针对这个课题国内外进行了很多研究。已有的研究表明,紧靠多角体基因上游的序列对基因的转录调节极为重要。当外源基因5’端加有1~58 个多角体蛋白的氨基酸编码序列以融合蛋白形式表达时,效果最好。Possee 等报道起始密码子ATG 上游69bp 是启动子发挥最大活性所必需的,但是减少至56bp 时活性降低为90%。但Johnson 等报道带有启动子和ATG 后5 个碱基的多角体序列融合外源基因时,其表达水平可相当于野生型多角体基因水平。Summers 等对多角体基因5’端进行突变,构建了一系列融合外源基因(氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖、组织血浆酶原激活因子)的表达载体,用SDS-PAGE和RNA 斑点分析外源目的基因转录的mRNA 和表达蛋白的水平,结果表明当多角体基因编码序列的一部分与外源基因融合时,可观察到最高的外源基因表达量和多角体基因相关mRNA 水平。这些研究结果表明多角体基因启动子上游序列对外源蛋白的基因转录非常重要,转录效率的提高会增加蛋白质的翻译水平,虽然详细机理目前尚不清楚。

此外,多角体基因的下游序列也会对外源基因的表达产生影响。改变外源基因的终止子密码,会对目的基因的转录效率产生影响,另外在目前开发的杆状病毒转移载体中,为提高表达效率在3’端常添加真核增强因子如SV40 序列等。

3 启动子类型的影响

目前,BEVS 中最常用的启动子有多角体Polh(polyhedrin)启动子和P10 启动子,此外还有碱性启动子以及少数早期启动子。同一外源基因在不同启动子控制下,表达水平有很大差异。研究发现,分泌类蛋白使用P10 启动子或碱性启动子的效果较好。P10 启动子的活性仅次于polh 启动子,在核内多角体形成的过程中,P10 蛋白参与了细胞核和细胞质中大量纤维状结构的形成。虽然p10 和polh 都在感染晚期大量表达,但并非同时进行。P10 蛋白的最高表达水平比多角体蛋白稍低一些,但表达却早一些。p10 启动子的转录、翻译都要比polh 提前12~24 h,可以让重组蛋白得到更好的转录后加工修饰。然而p10 基因缺失不能产生可识别的表型差异,不利于筛选重组病毒,所以p10 启动子在表达外源蛋白方面的应用并不广泛。

杆状病毒的感染过程可分为三个阶段:早期、晚期和极晚期。杆状病毒基因表达是在转录水平上调节的,每个阶段基因复制和表达依赖于前一阶段基因的表达。早期基因拥有能被宿主识别的启动子功能序列,其表达产物参与或调控病毒基因的复制和晚期基因的表达。昆虫体内早期基因表达产物增多或大量积累晚期和极晚期基因表达所需的相关蛋白和RNA,重组蛋白的表达水平也会显著提高。王厚伟指出向家蚕体表喷射昆虫保幼激素可促进外源基因的表达。这是因为保幼激素能抑制淀粉酶及蛋白分解酶的活性,也能抑制家蚕后部丝腺细胞内自噬体和溶酶体的产生及数量,延迟细胞液化,这与杆状病毒感染晚期对细胞的裂解作用相抗衡,由于病毒表达时间延长,在蚕体内积累了大量的病毒复制和外源基因表达所需的相关蛋白和RNA。也有研究报道,向病毒基因组中添加病毒DNA 元件也可以显著增加蛋白的表达水平。加入同源区1(hr1)和同源区3(hr3)序列区域可使荧光素酶的产量增加。同样,在重组病毒基因组中掺入一个来自龙虾原肌球蛋白cDNA 的5’非翻译前导序列的21 bp 元件,使原肌球蛋白和荧光素酶的产量分别提高了20 倍和7 倍,该5’非翻译前导序列包含Kozak 序列和发现于多角体前导序列的富含A 序列。杆状病毒同源重复区(hr1)序列是分散在杆状病毒基因组中的重复序列,已有研究证明hrl 既是杆状病毒复制原点,又具有增强子的作用。增强作用尽管在感染初期不明显,但在感染后期,变得比较显著。从机理上说,这些序列都有利于RNA 聚合酶与启动子的结合,从而提高外源基因的转录。

4 利用活体昆虫进行目的基因的表达

与昆虫培养细胞相比,利用昆虫幼虫或蛹能够显著提高目的基因的表达水平。家蚕幼虫中已高效表达了许多真核生物蛋白。Maeda 等第一次用BmNPV在家蚕幼虫的血淋巴中生产出人类α-干扰素。曾有报道,家蚕幼虫血淋巴中小鼠白介素-3 的活性分别比家蚕卵巢细胞(BmN)和非洲绿猴肾细胞(COS)中高20 倍和10,000 倍。感染家蚕的血淋巴中的丁酰胆碱酯酶活性分别比BmN 细胞和中国大鼠卵巢细胞(CHO)中的高23 和280 倍。通过杆状病毒表达系统可利用昆虫活体大规模生产各种重组蛋白。目前的研究已经表明,家蚕血液内存在能够显著促进病毒感染和表达的特殊蛋白质,如Promoting Protein。

尽管昆虫杆状病毒表达系统存在一些不足之处,但它在农业、基础分子生物学以及医学领域都具有极其重要的应用价值。随着对这一表达系统的基础理论研究的不断深入,其调控机理也将越来越清晰明了,新的调控因子及强的增强子也可能被发现。根据目前的研究,产生了许多能够提高外源基因表达水平的技术,如抑制目的蛋白降解、合理调控目的基因的转录、优化启动子类型以及利用活体昆虫而非培养细胞,如家蚕幼虫或蛹进行表达等。利用不断发展的技术将昆虫改造为高效蛋白表达的技术平台具有极其诱人的前景。

(作者:于少芳,吴小锋,提高昆虫杆状病毒表达系统重组蛋白表达水平的技术)

Souce: 纽普生物    2016-07-15