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DNA甲基化与限制性内切酶

你有没有用过XbaI或者ClaI酶?有没有遇到过比较奇葩的现象?你是否了解DpnI能消化模板DNA而不能消化掉新合成的DNA的原理?——以上都是因为相同的原因:DNA的甲基化。

为什么是甲基化?

限制性内切酶在实验室中随处可见,人们很容易忘记这些细菌来源的酶的真正功能。原核细胞为了保护自己,选择性地降解外源DNA,可保护个体免于外来DNA(如噬菌体)侵入的系统,主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。限制内切酶负责降解进入原核细胞的外源DNA,甲基化酶则对细胞自身的DNA进行甲基化,从而保护细胞的DNA,使其不被自己细胞内的限制性核酸内切酶降解。

除了上述限制性修饰系统,DNA甲基化在调节基因组复制,错配修复和促进/抑制蛋白表达过程中发挥作用。参与这些过程的甲基化酶(如DamDcm甲基化酶)与限制性修饰系统是独立的,但仍然可以影响某些限制性内切酶是否能有效地切开DNA

常见的实验室K12的大肠杆菌菌株如DH5alpha包含3种甲基化酶识别不同的DNA甲序列:

Dam甲基化酶在DNAGATC motiA上添加一个甲基。

Dcm甲基化酶在DNACCWGG的第二个C上添加一个甲基。

EcoKI甲基化酶在DNAAACNNNNNNGTGC或者GCACNNNNNNGTT motifA上添加甲基。

甲基化酶对克隆和酶切的影响

尽管不是所有的原核DNA有着相同的甲基化水平,但是在酶切消化的时候还是要考虑甲基化的影响。尽管有些甲基化酶不属于限制性修饰系统,但是他们识别的序列和有些内切酶的识别位点重合,从而抑制了这些酶的酶切功能。

比如XbaI的识别序列是TCTAGA,如果在该序列前面有GA紧邻或者该序列后面有TC接着,那么Dam的甲基化作用会使得XbaI切不开该位点。相反地,DpnI酶切要发挥活性则需要DNA发生甲基化。DpnI酶在定点突变中是一个很常用的酶,它一般用于老的DNA模板的去除。而这些老的DNA模板需要从dam+的大肠杆菌中提取才行,这样提取的DNA质粒上的GATC序列会带上甲基化修饰,刚好可以被DpnI酶给消化掉。而通过PCR扩增出来的新的DNA模板则会被保留。

如何知道某种内切酶会被甲基化修饰影响?

下面列出了被甲基化修饰抑制的常见10种限制性内切酶

Dam甲基化

Dcm甲基化

EcoKI甲基化

ApaI

无影响

有影响

无影响

BsaI

无影响

有影响

无影响

ClaI

有影响

无影响

无影响

DraI

无影响

无影响

有影响

HpaI

无影响

无影响

有影响

MboI

有影响

无影响

无影响

MscI

无影响

有影响

无影响

PmeI

无影响

无影响

有影响

XbaI

有影响

无影响

无影响

DpnI

甲基化存在的时候有活性

无影响

无影响

可以通过REBASE database查询更多的限制性内切酶的相关信息。

如何控制甲基化?

如果不想DNA质粒被甲基化,那么可以通过更换菌种来达到目的。如果你使用的限制性内切酶会被Dam或者Dcm甲基化酶的甲基化所block,那么可以将质粒转化到dam–/dcm–菌株,比如说JM110,然后重新制备质粒。值得注意的是,dam–/dcm–菌株由于缺少Dam的错配修复功能,所以DNA突变几率大增,所以该菌种不适合长期保存质粒。


Souce: 纽普生物    2016-07-15