小伙伴们开始自己的课题时，经典的出发点是从一类疾病模型的样本出发，找出异常表达基因作为新的研究对象，然后钻研其作用看看是否和疾病的发生发展相关联。一般来说，以测序作为筛选基因的手段是最为方便的了，那具体如何运用该手段进行自己的研究呢？今天麦子就以两篇文献为例，给大家拎拎思路。
例一
Increased expression of Solute carrier family 12 member 5 via gene amplification contributes to tumour progression and metastasis and associates with poor survival in colorectal cancer. Gut（IF: 13.319）.
SLC12A5通过基因扩增导致的表达升高对肿瘤进程与转移，以及对结肠癌预后的影响
本文策略
提出现象，抛出假设，予以解决
提出现象：首先从临床现象和科学问题出发。在世界范围中，结肠癌是男性中的诊断率排第三，女性中排第二的肿瘤。亚洲国家中，结肠癌发病增长很快，50-60%的病人有转移发生，这也是结肠癌致死的主要原因。结肠癌发病过程中，有很多拷贝数变异的现象，这会导致原癌基因的异常激活或是抑癌基因的异常失活。
抛出假设：分子机制研究切入点，20号染色体上的拷贝数异常与肿瘤发病有关，其中20q13.12在结肠癌中是异常扩增频率最高的区域之一，其中包括一些潜在的原癌基因。之前的报道用单细胞测序显示位于这个区域的SLC12A5基因，有激活的点突变发生。靶标区域测序显示182个结肠癌病人中仅7例（3.8%）有该基因的有害突变。由于该基因在结肠癌组织中表达丰富而相对的癌旁表达较低，因此研究人员猜测SLC12A5基因的异常扩增也许就是其激活的重要机制！
解决方案：三点入手，细胞表型、分子机制以及临床意义。
细胞表型：SLC12A5基因促进肿瘤细胞生长，抗凋亡，促进肿瘤细胞侵袭和转移。
分子机制：显示SLC12A5通过调节细胞周期例如cyclin D1和CDK4促进细胞增殖。敲除SLC12A5后，AIF和EndoG表达显著升高，提示SLC12A5可能是通过AIF和EndoG诱导的细胞凋亡起作用。SLC12A5下游通路可能涉及到p21等信号通路，另外，可能通过影响MMP2和MTSS1等蛋白增加肿瘤细胞转移能力。
临床意义：SLC12A5高表达与结肠癌较差的预后有关。Kaplan-Meier生存分析显示SLC12A5过表达结肠癌病人生存期更短。Univariate Cox regression 分析显示SLC12A5过表达与肿瘤高致死率有关。显示SLC12A5可能作为一个临床指标评估预后等情况。
例二
BRCC mutations in myeloid neoplasms. Haematologica(IF:5.814)
本文策略
利用新一代测序技术对骨髓异常增生综合征（MDS）中DNA损伤修复相关基因的新突变进行研究
首先同样从临床现象和科学问题出发：骨髓异常增生综合征（MDS）有多种特征，例如造血功能异常急性白血病发病倾向，以及一系列异常的分子事件，例如染色体异常和体细胞突变，其中包括一些与DNA损伤修复有关的基因造成突变积累。由于MDS发病过程中涉及到一些DNA损伤修复相关功能，研究人员希望通过新一代测序技术对DNA损伤修复相关基因的新突变进行研究。从之前的全外显子组测序结果中，研究人员关注了DNA损伤修复相关基因BRCC3。
针对靶标基因突变识别
对149个病人进行BRCC3基因的突变情况进行分析，在两个病人分别患有refractory cytopenia with multilineage dysplasia(RCMD) 和chronic myelomonocytic leukemia-1(DMML-1) 分别显示有两个异常突变，并对其进行sanger和targeted deep-DNA sequencing验证。对各种髓系肿瘤的扩大样本1444个病人中进行靶标序列测序，共发现28（1.9%）个BRCC3突变。
挖掘机制，BRCC3的遗传显著性分析
28个BRCC3突变包括12个nonsense，6个missense，5个splice site，4 frameshift和非frameshift变异。深度测序显示其中有病人的BRCC3突变，出现在RCMD诊断时也贯穿RAEB进化过程中（20个月后）。显示BRCC3突变可能是一个早期事件。另外分析了有BRCC3突变病人伴随的其他突变，包括一些功能重要的基因，共有23个基因被发现，其中TET2和SF3B1频率最高。SNP-A karyotyping检测，发现677个病人中有7个显示了BRCC3基因的缺失情况。另外，没有发现BRCC3变异与其mRNA表达直接的关系。
临床表型与BRCC3突变的关系
将BRCC3 变异与病人临床表型相关分析，发现BRCC3突变与高龄显著相关，而不同性别之间，男性略微高于女性。细胞遗传学上来看，该基因变异与Y染色体异常有关；核型分析显示，WT和突变组核型异常没有显著区别。表型分析显示，在高MDS风险和低MDS风险组中均有BRCC3突变，以及MDS/MPN组中类似，但是sAML和MPN组中无突变。另外，BRCC3突变与整体生存率无影响。
机制研究
对mouse lineage-Sca-1+c-kit+(LSK)细胞系进行BRCC3敲除实验，显示敲除BRCC3的细胞克隆形成能力显著增加。另外发现敲除BRCC3还导致了细胞中度分化受阻，流式细胞术检测发现前导靶标c-Kit表达上升，分化marker Gr-1的表达降低。
上述两个例子都是从细胞、分子和临床三个方面，研究了基因在疾病中异常表达的情况及其临床意义。测序是一种筛选的手段，后续的研究还是要靠实打实的付出和努力，小伙伴们是否有所收获呢？
来源：解螺旋，医生科研助手
2016-05-20