成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：

1. 凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析

2. 吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析

3. 处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上

4. 处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测

成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：

• 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率

• 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性

• 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性

• 内参对照：检测标本的质量和二抗系统

• 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果

WB检测基本过程

1、获取细胞或组织裂解物

1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：

蛋白位置	推荐buffer
全细胞	NP-40 or RIPA
胞浆（可溶性蛋白）	Tris-HCl
胞浆（骨架结合蛋白）	Tris-Triton
膜蛋白	NP-40 or RIPA
核蛋白	RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白	RIPA or 线粒体分离试剂盒

亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量

2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！

2、蛋白定量

常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCAassay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白

3、电泳分离蛋白质

根据待测蛋白状态确定电泳条件：

待测蛋白状态	凝胶条件	上样buffer	电泳buffer
Reduced - Denatured	还原，变性	含β-巯基乙醇或DTT，含SDS	含SDS
Reduced -Native	还原，不变性	含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS	不含SDS
Oxidized - Denatured	不还原，变性	不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS	含SDS
Oxidized - Native	不还原，不变性	不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS	不含SDS

根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度

蛋白分子量（kDa）	凝胶浓度（％）
4-40	20
12-45	15
10-70	12.5
15-100	10
25-200	8

4、转膜

根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有：PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：

	PVDF膜	NC膜	尼龙膜
灵敏度和分辨率	高	高	高
背景	低	低	较高
蛋白结合能力	100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合）	80-100ug/cm2	>400ug/cm2
机械强度	强	干的膜易脆	软而结实
溶剂抗性	强	差	差
使用前是否需要浸润	100%甲醛润湿	缓冲液润湿	缓冲液润湿
适用染色方法	胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰	胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁	不能用阴离子染料
适用检测方法	显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测	显色法、化学发光、荧光、放射性	显色、化学发光、放射性
适用范围	普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测	普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白	低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用
价格	高	较低	低

5、封闭

去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS

6、一抗孵育

一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：

• 选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）

• 选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）

• 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体

一抗的保存和使用：

• 根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。

• 抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周

• 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:100-1:3000）。

• 孵育条件：推荐4°C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别

内参的选择和使用：WB过程监测以及目的蛋白定量的标准！

WB常用内参及其技术参数：

内参名称	分子量大小	适用范围
beta-actin	43kDa	胞浆和全细胞
GAPDH	30-40kDa	胞浆和全细胞
Tubulin	55kDa	胞浆和全细胞
VCDA1/Porin	31kDa	线粒体
COXIV	16kDa	线粒体
TBP	38kDa	细胞核

7、二抗孵育

根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时

8、底物孵育

选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量

9、结果分析和检测

凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片

Note：从封闭开始，每步之间都需要用TBST进行洗涤，3次，每次5min

WB常见问题及技术要点：

WB过程中常见的问题及可能原因分析

问题	可能原因	验证或解决办法
转膜不充分	膜没有完全均匀湿透	使用100% methanol浸透膜
	靶蛋白分子量小于10,000	选择小孔径的膜，缩短转移时间
	靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值	可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液
	甲醇浓度过高	过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替
	转移时间不够Thick gel	对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间
背景高	膜没有完全均匀湿透	使用100% methanol浸透膜
	洗膜不充分	增加洗液体积和洗涤次数
	阻断不充分	增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）
	二抗浓度过高	降低二抗浓度
	检测过程中膜干燥	保证充分的反应液，避免出现干膜现象
	曝光过度	缩短曝光时间
	抗体与阻断蛋白有交叉反应	检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应
没有阳性条带	抗体染色不充分	增加抗体浓度，延长孵育时间
	酶失活	直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
	标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低	设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。
	试剂不匹配	一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性
	一抗失效	选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液
	HRP抑制剂	所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
有阳性条带，但条带比较弱	抗体染色不充分	增加抗体浓度，延长孵育时间
	酶活性降低	直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
	标本中靶蛋白含量太低	增加标本上样量。
	洗膜过度	缩短洗涤时间
	HRP抑制剂	所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
	抗体活性降低	选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置
	蛋白转移不充分	见上述
	封闭过度	减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型
	曝光时间过短	延长曝光时间
	HRP抑制剂	所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
条带位置（大小）不对；或有非特异性条带	二抗的非特异性结合	增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）
	一抗的特异性不够	使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性
	蛋白降解	使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂
	二聚体或多聚体存在	增加蛋白质变性过程及强度
	抗体浓度过高	降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带
	蛋白上样量过大	降低上样量
背景有斑点	封闭剂中有聚集体	使用前过滤封闭试剂
	HRP耦联二抗中有聚集体	过滤二抗试剂，去除聚集体
膜上出现反像（暗背景上白色带）	HRP含量过高	降低酶联二抗的浓度

2016-05-12