作者：解螺旋.流氓兔 解螺旋原创

作为资深分子生物学菜鸟，qPCR一直是心中的痛。从RNA抽提到逆转录再到加样以及数据分析，好像每一步都可以让整个实验挂掉。引物设计是非常重要的一个环节，之前解螺旋也给大家分享了多种引物设计的软件以及方法，在解螺旋的公众号下回复“21”可看到《告别菜鸟——设计PCR引物“一招鲜”》，此文介绍了引物设计的原理以及如何在NCBI上查找序列再运用PP6等软件设计引物；回复“318”可看到《如何用primer-blast设计和验证引物》，此文推荐了NCBI的一款在线工具primer-BLAST，用于PCR的特异性引物设计和特异性检验。听了这么多道理，然而我依然设计不好引物……

那么问题来了，有没有比这些更简单粗暴的引物获取方法呢？如果你是一只懒癌患者以及只是用到那么一两次需要自己设计qPCR引物，那么本文相当地适合你。分分钟搞定qPCR引物。

这个神器就是primerbank。网址：

http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

这是哈佛大学的一个qPCR引物数据库，目前有超过20万条引物，涵盖了人和小鼠大部分已知的基因。根据网站上对两万多对引物的验证结果，引物有效率为82.7%。当然他们只验证了小鼠的引物。

我们如何从上面获取所需的qPCR引物呢？

回到首页，可以看到有三个可选择的框框，搜索类型，物种，以及输入框。

搜索类型这里，可以根据GenBank accession、NCBI protein accession、NCBI gene ID、primerbank ID、NCBI gene symbol以及keyword六个选项进行搜索。比如我们选择keyword，搜索小鼠的beta-actin。

出来就是酱紫的：

居然木有！！不是说好涵盖大部分基因的咩！居然木有！！

好吧，实际上是为嘛呢，是因为keyword的搜索并不准确，比如beta-actin我们可能写成β-actin，primerbank识别不了，自然就找不到引物了。这样其他的几个搜索类型就派上用场了。比如我们选择NCBI gene ID对β-actin进行搜索：

首先我们要到NCBI上去找出来β-actin的gene ID，如图，选择gene,输入beta-actin：

出来是酱紫的：

一堆一堆的结果。我们点击右边的分类musmusculus：

结果就出来了，小鼠beta-actin的NCBI gene ID是11461，而actb则是小鼠beta-actin的NCBI gene symbol。我们把11461输入到primerbank里面试试：

结果是酱紫的：

在这个结果上我们可以看到beta-actin的NCBI gene ID、GenBank accession、NCBI protein accession、coding DNA length等信息。输入beta-actin的NCBI genesymbol actb：

结果是酱紫的：

实际上跟上面的NCBI gene ID搜出来结果一样，往下拉我们还能看到经过验证的引物：

点进去可以看到溶解曲线、电泳结果等信息：

尽量选择这种验证过的引物，品质比较有保障。但是对于人来说是没有经过验证引物的，不放心的话怎么办呢？回到我们前面所讲的《如何用primer-blast设计和验证引物》进行验证一下就好啦。是不是so easy，老板再也不用担心我搞不定qPCR引物了。

嗯，实际上，这是授人以鱼，如果要学会捕鱼的话，还是认真学学我们前面的两篇引物设计的文章吧！

2015-08-12