qPCR引物与普通PCR引物的设计虽然在设计原则和方法上大致相同，但还是有些不一样的地方，严格的qPCR引物设计一般要求其中一条引物要夸外显子，最好在3‘端设计引物，产物的长度在300bp以内等。小编今天给大家介绍的这个在线软件Primer3 Plus和Oligo Calc，可以满足大家对qPCR引物设计日益增高的要求。
第一步：从数据库Ensembl：http://asia.ensembl.org/index.html中获得基因的cDNA序列。
1. 本文以ApoE基因为例，输入目的基因
2. 在左侧栏选择Transcript
3. 选择APOE-001中的Transcript进入，点击左侧cDNA
4. 然后点击CONFIGURE THIS PAGE进入,设置你要显示的内容, 在SHOW EXONS这一项打个勾，然后点击“Save configuration as”保存序列
5. 以RTF的格式DOWNLOAD下来，可以Word的方式打开，不同的颜色代表不同外显子的间断
第二步：利用Primer3 Plus获取引物，打开Primer3 Plus在线软件：http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cg
1. 打开Primer3 Plus，将序列粘贴在指定位置
2. 在Load server settings项目中选择“qPCR”：
因为设计为避免因基因组DNA的污染而P出以基因组DNA为模板的产物，故设计引物时其中一个引物最好能够夸外显子设计，故在Primer overlap position中输入左引物或右引物必须重叠的位点，本文在序列238位氨基酸是后两个外显子的连接处，故输入238。或者可以在Pair OK Region List中，作相应的设置，该标签的值为多个，值和值之间用“;“隔开，单个值为：<left_start>,<left_length>,<right_start>，<right_length>。比如：SEQUENCE_PRIMER_PAIR_OK_REGION_LIST=100,50,300,50 ;900,60,, ; ,,930,100
表明有引物设计有三种选择：
左引物在100～150bp区间进行设计，右引物在300～350bp的区间进行设计；
左引物在900～960bp区间进行设计，右引物随意；
右引物在930～1030bp区间进行设计，左引物随意。
3. 然后在General Settings设置引物长度、引物Tm值、GC含量等参数。
4. 如果对引物有更多的设计要求:
可以在Advanced Settings、Internal Oligo、Penalty、Andvanced Sequence中设置相关的参数。如无则可点击绿色按钮“Pick Primers”,获得引物。
第三步：分析引物
1. 打开Oligo Calc网页，将正向引物粘贴到指定位置
2. 点击Check Self-complmentarity,检测引物自身是否形成互补二聚体、发夹结构等。
3. 结果如下图所示：
4. 重复步骤1至3，粘贴反向引物。
5. 点击mfold
将包含正反引物之间的序列即产物放到mfold,查看产物是否折叠形成二级结构。如结果显示产生二级结构，则可重新在Primer3 plus改变条件重新获得qPCR引物。
6. 最后点击BLAST，检测引物的特异性。
经过层层筛选，最后得到符合条件的引物实在是凤毛麟角，所谓鱼和熊掌不可兼得，所以可能得将就一下接受各方面都不错但还是有一点不完美的引物，而且引物好不好用，也只有realtime PCR以后才能得到验证。所以，请大胆地去pick primers吧！
作者：解螺旋.翠花解螺旋出品
2015-07-22