1.  用50 ml 底物缓冲液洗膜两次以平衡膜，每次15 min。

2.  对于使用硝酸纤维素膜或PVDF膜进行的碱性磷酸酶反应：膜置于Nitro-Block溶液中5 min，然后以50 ml 底物缓冲液洗5 min。

3.  将膜移入显迹液中，浸泡30 s 或5 min。

4.  取出膜，滴干水份，将膜正面朝下放在一张透明的塑料保鲜膜上，向后折叠用保鲜膜将膜紧密包裹起来。

5.  在暗房中，将膜正面朝下放在感光胶片上，曝光时间取决于样品，放射自显影几秒或过夜。

6.  如果需要，可用50 ml TBS溶液洗膜15 min，再进行发色显迹。