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I标记的单克隆抗体能与具有相应抗原的细胞结合，有数百倍以上未
标记的特异性抗体同时存在的条件下，则标记抗体的结合受到竞争性抑制。根据不
同稀释度抗体分别与相同数量细胞结合后所测得的特异性计数值，可以计算出每个
细胞表面的平均抗原密度以及抗原和抗体的亲和力。
1. 硅化规格相同的5 ml玻璃管，双蒸水冲净后烤干，
每次实验分6～12组，每组5支试管
2. 将
125
I标记抗体和非标记抗体分别用结合缓冲液作
倍比稀释
3. 在同一组5个试管中每管加入10 μl标记抗体，4、
5管加入10 μl未标记抗体（浓度高于同组标记抗体
100倍以上），1、2、3管补加10 μl结合缓冲液
4. 洗涤分离或培养的细胞，用结合缓冲液调整细
胞浓度为5×10
5
～1×10
6
/80 μl，每管中加入
80 μl细胞悬液
5. 轻轻振摇后在4 ℃条件下（冷室或冰浴上）
孵育30 min
特异性计数值＝总计数值（每组1、2、3管平均cpm值）—非特异性计数值（每组 4、5管平均cpm值）。
结果用LIGAND和EBDA微机程序进行Scatchad分析，计算出细胞表面抗原密 度以及抗原与抗体结合的亲和力。
6. 将孵育后的细胞悬液叠加于预先置小塑料
管内的200 μl分离液上
7. 台式高速离心机10000 g 2 min
8. 切下位于管底细胞小团
9. γ计数
计算
特异性计数值＝总计数值（每组1、2、3管平均cpm值）—非特异性计数值（每组 4、5管平均cpm值）。
结果用LIGAND和EBDA微机程序进行Scatchad分析，计算出细胞表面抗原密 度以及抗原与抗体结合的亲和力。
注意事项
1. 每管所需要细胞数根据细胞种类而定，一般在5×10
5
～1×10
6
/管，若用
血小板可用1×10
8
/管。
2. 所用McAb要求纯度好、活性高。用氯胺-T法标记抗体时，氯胺-T作用时间 不要超过30 秒，比活性以3～6 μci/μg McAb为宜，标记率在50～70 ％，保持 125 I标记后McAb的结合活性。
3. 细胞、抗体等计数、取样要精确。
4. 孵育时间和温度视竞争结合试验所用细胞和抗体的不同有所差别，可在室 温或37 ℃条件下进行，孵育时间30 min～4 h不等。
5. 在整个操作过程中防止未标记抗体对只加标记抗体管的污染，否则会使整 个实验失败。
2. 所用McAb要求纯度好、活性高。用氯胺-T法标记抗体时，氯胺-T作用时间 不要超过30 秒，比活性以3～6 μci/μg McAb为宜，标记率在50～70 ％，保持 125 I标记后McAb的结合活性。
3. 细胞、抗体等计数、取样要精确。
4. 孵育时间和温度视竞争结合试验所用细胞和抗体的不同有所差别，可在室 温或37 ℃条件下进行，孵育时间30 min～4 h不等。
5. 在整个操作过程中防止未标记抗体对只加标记抗体管的污染，否则会使整 个实验失败。
2014-12-12