尽管辣根过氧化物酶（HRP）可以催化Luminol-H 2 O 2 反应体系产生化学发光， 但由于该体系的检测灵敏度不够高，不能满足酶联免疫测定的要求。因此，为了提 高体系的检测灵敏度，可将HRP催化H 2 O 2 氧化曙红（Eosin）的反应与该反应产物增 强HRP催化luminol-H 2 O 2 的化学发光反应相偶合，建立偶合放大化学发光酶联免 疫分析法。这里，酶的活性是基于下列发光反应进行检测的
HRP
luminol＋H
2
O
2
───→产物＋hν
产 物
↑
Eosin＋H 2 O 2 ────┘
HRP
↑
Eosin＋H 2 O 2 ────┘
HRP
血清中HBsAg含量越高，结合的酶标抗体越多,则偶合放大化
学发光强度越强；反之亦然。因此，可以根据检测到的化学发光光强度来间接定量
人血清中HBsAg的水平。
1. 定性
按下列公式判别阴、阳性
2. 定量
以不同稀释度的HBsAg阳性标准品的化学发光强度为纵坐标，不同 稀释倍数为横坐标，作出剂量反应曲线（标准曲线），待测样品中HBsAg的含量就 可由测量的化学发光强度换算得到。
按下列公式判别阴、阳性
L样品－L空白 ┌≥2.1 为阳性
S/N ＝ ──────── ＝ 商│
L阴性对照－L空白 └＜2.1 为阴性
2. 定量
以不同稀释度的HBsAg阳性标准品的化学发光强度为纵坐标，不同 稀释倍数为横坐标，作出剂量反应曲线（标准曲线），待测样品中HBsAg的含量就 可由测量的化学发光强度换算得到。
1. 包被抗体
在每个小试管中加入聚苯乙烯珠各一枚，再加入300 μl用0.05 M， PH9.6 碳酸盐缓冲液稀释的抗HBsAg抗体，同时设空白对照，置4 ℃过夜。
2. 洗涤
用抽滤针头吸干管内液体，加入Tris-HCl-Tween20洗涤3 次，每次加 2 ml，放置3～5 min，用抽滤针头吸干管内液体。
3. 加待检血清和阳性标准品
用PBS-Tween20缓冲液不同倍数稀释HBsAg阳性 标准品或待检血清，每管加入300 μl。同时设阴性对照，空白对照管只加抗体稀释液。 置37 ℃孵育2 h。
4. 洗涤
同2。
5. 加酶标抗体
用含小牛血清的PBS-Tween20缓冲液稀释HRP标记的抗HBsAg 抗体，每管加入300 μl，空白对照管只加用于稀释酶标抗体的稀释液。置37 ℃孵育 2 h。
6. 洗涤
同2。
7. 化学发光测定
给每管加入300 μl底物溶液，置37 ℃保温20 min。然后将小 试放入LKB-1250 lumimeter中，并置于测量位置，加入300 μl 5.0×10－4 M luminol。 记录仪记录化学发光强度。
8. 同时用ELISA方法进行对照，结果测量采用DG3022型酶联免疫检测仪。
在每个小试管中加入聚苯乙烯珠各一枚，再加入300 μl用0.05 M， PH9.6 碳酸盐缓冲液稀释的抗HBsAg抗体，同时设空白对照，置4 ℃过夜。
2. 洗涤
用抽滤针头吸干管内液体，加入Tris-HCl-Tween20洗涤3 次，每次加 2 ml，放置3～5 min，用抽滤针头吸干管内液体。
3. 加待检血清和阳性标准品
用PBS-Tween20缓冲液不同倍数稀释HBsAg阳性 标准品或待检血清，每管加入300 μl。同时设阴性对照，空白对照管只加抗体稀释液。 置37 ℃孵育2 h。
4. 洗涤
同2。
5. 加酶标抗体
用含小牛血清的PBS-Tween20缓冲液稀释HRP标记的抗HBsAg 抗体，每管加入300 μl，空白对照管只加用于稀释酶标抗体的稀释液。置37 ℃孵育 2 h。
6. 洗涤
同2。
7. 化学发光测定
给每管加入300 μl底物溶液，置37 ℃保温20 min。然后将小 试放入LKB-1250 lumimeter中，并置于测量位置，加入300 μl 5.0×10－4 M luminol。 记录仪记录化学发光强度。
8. 同时用ELISA方法进行对照，结果测量采用DG3022型酶联免疫检测仪。
注意事项
1. 洗涤要彻底，以免因血清中其他来源的过氧化物酶类物质所产生的非特异性反
应，而影响测定结果。
2. 实验中，应分别设置阳性、阴性、空白对照来控制实验条件，且每份样品 均应做三个复管，以保证实验结果的准确性。
3. 为了克服酶标抗体因非特异性吸附而造成的较高本底，可用适量小牛血清 加以抑制。
4. 当加入luminol后，迅速产生化学发光并使发光在一秒钟内达到峰值，然后 很快衰减到基线水平。因此，只有当小试管置于仪器的测量位置时，方可加入 luminol。
5. 底物的加入，是为了增强化学发光强度。但只有当底物分子与酶催化活性 中心充分接触时，反应速度才能加快。当反应进行15 min达到平衡时，牷学发光强 度则不再随时间的延长而变化，且在1 h内保持稳定，因此，控制底物与酶反应15 min 后加luminol进行化学发光测定。
2. 实验中，应分别设置阳性、阴性、空白对照来控制实验条件，且每份样品 均应做三个复管，以保证实验结果的准确性。
3. 为了克服酶标抗体因非特异性吸附而造成的较高本底，可用适量小牛血清 加以抑制。
4. 当加入luminol后，迅速产生化学发光并使发光在一秒钟内达到峰值，然后 很快衰减到基线水平。因此，只有当小试管置于仪器的测量位置时，方可加入 luminol。
5. 底物的加入，是为了增强化学发光强度。但只有当底物分子与酶催化活性 中心充分接触时，反应速度才能加快。当反应进行15 min达到平衡时，牷学发光强 度则不再随时间的延长而变化，且在1 h内保持稳定，因此，控制底物与酶反应15 min 后加luminol进行化学发光测定。