标记抗体的应用技术-免疫斑点试验

硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强的静电吸附力,在中性条件下即可有效 地吸附蛋白质等生物大分子。因而,将抗原吸附于纤维素膜后,就可利用纤维素膜 作为固相进行抗原抗体反应。当加入抗体后(即可与膜上的抗原结合),然后再加入 带有标记物的抗体,使标记通过抗抗体和相应抗体的结合间接地交联于纤维素膜 上。加入标记物相应的底物后,标记物即可与底物作用形成不溶性产物,呈现斑点状 着色,从而判定结果。根据所用的标记物不同,可分为:辣根过氧化物酶免疫斑点试 验(使用辣根过氧化物酶作为抗抗体的标记物),碱性磷酸酶免疫斑点试验(使用碱性 磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物作为酶标记物)和金银染色免疫斑点试验(使用胶体金 作为抗抗体的标记物)等。其中,最常用的是以辣根过氧化物酶标记系统为基础的免 疫斑点试验。
一、辣根过氧化物酶免疫斑点试验

1.  将0.01 M PBS PH7.4 稀释的抗原液2 μl

点于硝酸纤维素膜(或醋酸纤维素膜)上
2.  置37 ℃温箱中干燥20~30 分钟

3.  滴加封闭液37 ℃温盒中封闭10 分钟
4.  用洗涤液洗1~2 次,滤纸吸干
5.  加用稀释液稀释的抗体或待检标本,置 37 ℃湿盒中30 分钟
6.  用洗涤液震洗3 次×3 分钟、吸干
7.  水洗终止反应,观察结果。出现明显综 色斑点者为阳性

二、碱性磷酸酶免疫斑点试验

1.  将0.01 M PBS PH7.4 稀释的抗原液2 μl
点于硝酸纤维素膜上
2.  置37 ℃温箱中干燥20~30 分钟
3.  用封闭液37 ℃湿盒中封闭10 分钟
4.  用洗涤液震洗1~2 次,滤纸吸干

5.  加稀释液稀释的小鼠抗体或待检标本, 置室温湿盒中30 分钟
6.  用洗涤液震洗3 次×3 分钟,吸干
7.  加1∶50稀释的兔抗鼠IgG或羊抗鼠IgG血清, 置室温湿盒中30 分钟、洗同前、吸干
8.  加APAAP复合物于膜上、室温湿盒中30 分 钟,洗同前、吸干

9.  加1∶50稀释的抗鼠IgG血清,置室温湿
盒中10分钟,震洗1次、吸干
10.  加APAAP复合物,温育、洗涤同“9”
11.  重复“9”和“10”1~3次
12.  洗涤液震洗3次×3分钟、吸干
13.  滴加新配底物溶液显色5~10分钟,水洗中 止反应,观察结果
注意事项
一、免疫斑点试验的影响因素

1.  包被N、C膜的抗原浓度对试验结果影响较大。多以蛋白质含量500~
1000 μg/ml为宜。浓度过高可出现假阳性,过低则降低试验的敏感性。

2.  酶结合物浓度对试验成功与否至关重要。最适浓度常与包被抗原浓度有
关,应根据试验具体条件作方阵滴定来确定。

3.  显色时间,一般认为5-10 分钟较好。显色时间过长常导致本底着色加深,降
低试验的特异性。

4.  用抗原包被NC检测抗体时,待检样品加样不宜过多。加样过多可使相邻的
样品混淆,一般5~10 μl即可。

2014-12-12