脊髓损伤与修复反应受多种因素影响，是有多种分子参与的复杂的病理过程，目前其分子机理仍不明确，因而无法找到有效干预措施。脊髓损伤与修复蛋白39（spinal cord injury and regeneration re?lated protein 39，SCIRR39）基因是我们克隆到的在大鼠脊髓损伤及修复过程中上调表达的基因，是大鼠核糖核酸酶抑制因子基因的突变体，其编码的蛋白以前只发现存在于胞浆内，而近年有报道显示该蛋白还存在于细胞核及线粒体中，但功能不详。为进一步研究该蛋白在中枢神经系统和其他组织中的分布，及其在脊髓损伤修复过程中可能的作用，我们制备了针对该蛋白的特异性抗体，为中枢神经系统损伤与修复机理研究提供有效的临床干预线索。
1 实验方法
1.1 PCR扩增Scirr39 基因
1.2 pGEX-GST-SCIRR39-C融合表达载体的构建
1.3 GST-SCIRR39-C融合蛋白的原核表达和纯化
1.4 SCIRR39-C抗原表位蛋白的分离(切除GST标签)
用1 mL注射器，将80 μL凝血酶与920 μL 1×PBS的混合液注入GST rap柱，封闭柱两端，23~24℃放置16 h；采用1 mL 注射器，用3 mL 1×PBS 以1mL/min 的流速洗下柱中解离下来的SCIRR39-C 蛋白（悬于冰上操作），随后用10 mL 洗脱缓冲液以1mL/min 的流速洗脱柱中的GST 蛋白（悬于冰上操作），以评价凝血酶酶切效率。纯化后的SCIRR39-C蛋白经冷冻干燥浓缩，以备检测抗体效价时使用。
1.5 抗体制备
取饲养1 周、体质量为2.5 kg 的纯种日本大耳白兔，免疫前从耳缘静脉取正常血清作为对照。将1 mg 抗原与等体积弗氏完全佐剂混合直到形成乳浊液，采用背部多点皮下注射；2周后，取1 mg抗原与等体积弗氏不完全佐剂充分混匀，背部多点注射进行二次加强免疫；免疫后7~10 d 从耳缘静脉取血，ELISA 测定抗体效价，若滴度小于1∶1000，进一步加强免疫，要求每2周免疫一次，直到抗体效价达到所需滴度；到所需滴度后的第10 d 从颈动脉采血，采集的血液室温斜置30 min，移到4℃冰箱待血清析出，收集血清后1000 r/min 离心10 min，0.5mL/支分装，-70℃保存备用。
1.6 ELISA测定抗体滴度
用pH9.6的包被缓冲液将免疫所用蛋白稀释至所需浓度（100 ng/100 μL），在酶标板每孔中加入100 μL，并将板置于湿盒中，4℃过夜或37℃保温4h；用PBS-T洗板3次后每孔加入200 μL封闭液，于37℃保温1 h，随后用PBS-T 洗板3 次；一抗用生理盐水进行1/10 梯度稀释，100 μL/孔，4℃过夜，用PBS-T洗板3次，接着进行二抗反应，37℃保温2 h，用PBS-T洗板3次；进行显色反应，用BIO-RAD 680酶标仪测定D492nm值。
1.7 Western印迹检测抗体特异性
取SCIRR39-C 重组抗原表位蛋白进行SDSPAGE，采用预染蛋白标准以便于检测转移效率。15 V 以下恒压转移45 min，于1%脱脂牛奶中室温封闭1 h，加入制备的一抗Anti-SCIRR39（1∶500）室温孵育1 h，用0.1% PBST洗3次，各10 min；以封闭液稀释HRP标记的二抗（1∶2000），与硝酸纤维素膜一起于室温共孵育1 h；用0.1% PBST洗3次，各10min；ECL试剂显色。
2 结果与讨论
由于SCIRR39是新近发现的大鼠RNase抑制剂（RNH）的同源蛋白，目前尚无针对其的商业化特异性抗体，而为了研究SCIRR39 在神经系统的分布及其在脊髓损伤/修复过程中可能的作用，以至其他功能，我们要制备针对其的特异性抗体。为此，我们采用GST 融合蛋白表达系统表达重组SCIRR39。该表达系统可以高效表达融合蛋白，且产物易纯化，用凝血酶切除GST也比较容易。但由于原核细胞中缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，以及在重组蛋白表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，且表达环境不同于真核细胞，无法形成正确的次级键等原因，故使得表达的融合蛋白很难折叠成正确的空间构象。我们在表达SCIRR39全长蛋白时就遇到这方面的重重困难，由于蛋白序列中含有多达32个Cys残基，很可能在表达过程中发生二硫键错配，使得我们没有得到目的蛋白。而通过降低诱导温度和IPTG浓度等方法也没有提高蛋白的可溶表达量，这种极少量的目的蛋白对于抗体制备来说是远远不够的。因此，我们选择表达抗原表位的方法制备抗体。通过抗原表位分析，选择C端359~461位103个氨基酸残基作为SCIRR39 的抗原表位，免疫家兔制备多克隆抗体。经过对宿主菌的选择及诱导条件的优化，我们将构建的重组质粒诱导表达；之后用纯化的SCIRR39 免疫成年日本大耳白兔，得到了针对SCIRR39 的多克隆抗体，该兔抗血清的ELISA 效价约为1∶10000，表明抗血清具有较好的特异性。SCIRR39 重组蛋白多克隆抗体的成功制备，为进一步深入研究其生物学功能提供了良好的工具。
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201411121135.html
(by admin)
1 实验方法
1.1 PCR扩增Scirr39 基因
1.2 pGEX-GST-SCIRR39-C融合表达载体的构建
1.3 GST-SCIRR39-C融合蛋白的原核表达和纯化
1.4 SCIRR39-C抗原表位蛋白的分离(切除GST标签)
用1 mL注射器，将80 μL凝血酶与920 μL 1×PBS的混合液注入GST rap柱，封闭柱两端，23~24℃放置16 h；采用1 mL 注射器，用3 mL 1×PBS 以1mL/min 的流速洗下柱中解离下来的SCIRR39-C 蛋白（悬于冰上操作），随后用10 mL 洗脱缓冲液以1mL/min 的流速洗脱柱中的GST 蛋白（悬于冰上操作），以评价凝血酶酶切效率。纯化后的SCIRR39-C蛋白经冷冻干燥浓缩，以备检测抗体效价时使用。
1.5 抗体制备
取饲养1 周、体质量为2.5 kg 的纯种日本大耳白兔，免疫前从耳缘静脉取正常血清作为对照。将1 mg 抗原与等体积弗氏完全佐剂混合直到形成乳浊液，采用背部多点皮下注射；2周后，取1 mg抗原与等体积弗氏不完全佐剂充分混匀，背部多点注射进行二次加强免疫；免疫后7~10 d 从耳缘静脉取血，ELISA 测定抗体效价，若滴度小于1∶1000，进一步加强免疫，要求每2周免疫一次，直到抗体效价达到所需滴度；到所需滴度后的第10 d 从颈动脉采血，采集的血液室温斜置30 min，移到4℃冰箱待血清析出，收集血清后1000 r/min 离心10 min，0.5mL/支分装，-70℃保存备用。
1.6 ELISA测定抗体滴度
用pH9.6的包被缓冲液将免疫所用蛋白稀释至所需浓度（100 ng/100 μL），在酶标板每孔中加入100 μL，并将板置于湿盒中，4℃过夜或37℃保温4h；用PBS-T洗板3次后每孔加入200 μL封闭液，于37℃保温1 h，随后用PBS-T 洗板3 次；一抗用生理盐水进行1/10 梯度稀释，100 μL/孔，4℃过夜，用PBS-T洗板3次，接着进行二抗反应，37℃保温2 h，用PBS-T洗板3次；进行显色反应，用BIO-RAD 680酶标仪测定D492nm值。
1.7 Western印迹检测抗体特异性
取SCIRR39-C 重组抗原表位蛋白进行SDSPAGE，采用预染蛋白标准以便于检测转移效率。15 V 以下恒压转移45 min，于1%脱脂牛奶中室温封闭1 h，加入制备的一抗Anti-SCIRR39（1∶500）室温孵育1 h，用0.1% PBST洗3次，各10 min；以封闭液稀释HRP标记的二抗（1∶2000），与硝酸纤维素膜一起于室温共孵育1 h；用0.1% PBST洗3次，各10min；ECL试剂显色。
2 结果与讨论
由于SCIRR39是新近发现的大鼠RNase抑制剂（RNH）的同源蛋白，目前尚无针对其的商业化特异性抗体，而为了研究SCIRR39 在神经系统的分布及其在脊髓损伤/修复过程中可能的作用，以至其他功能，我们要制备针对其的特异性抗体。为此，我们采用GST 融合蛋白表达系统表达重组SCIRR39。该表达系统可以高效表达融合蛋白，且产物易纯化，用凝血酶切除GST也比较容易。但由于原核细胞中缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，以及在重组蛋白表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，且表达环境不同于真核细胞，无法形成正确的次级键等原因，故使得表达的融合蛋白很难折叠成正确的空间构象。我们在表达SCIRR39全长蛋白时就遇到这方面的重重困难，由于蛋白序列中含有多达32个Cys残基，很可能在表达过程中发生二硫键错配，使得我们没有得到目的蛋白。而通过降低诱导温度和IPTG浓度等方法也没有提高蛋白的可溶表达量，这种极少量的目的蛋白对于抗体制备来说是远远不够的。因此，我们选择表达抗原表位的方法制备抗体。通过抗原表位分析，选择C端359~461位103个氨基酸残基作为SCIRR39 的抗原表位，免疫家兔制备多克隆抗体。经过对宿主菌的选择及诱导条件的优化，我们将构建的重组质粒诱导表达；之后用纯化的SCIRR39 免疫成年日本大耳白兔，得到了针对SCIRR39 的多克隆抗体，该兔抗血清的ELISA 效价约为1∶10000，表明抗血清具有较好的特异性。SCIRR39 重组蛋白多克隆抗体的成功制备，为进一步深入研究其生物学功能提供了良好的工具。
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201411121135.html
(by admin)
2014-11-12