在动物体内，脂肪酸的来源有2种，即外源日粮摄取和体内从头合成，后者主要是通过脂肪酸合酶（FASN）的催化作用来实现的。FASN是调控脂肪酸合成代谢的关键酶，它利用乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A和还原型辅酶Il（NADPH）催化长链饱和脂肪酸的合成。乙酰/丙二酸单酰基转移酶（Mal-onyl/Acetyltransferase，MAT）是FASN的一个功能域。对于反刍动物而言，MAT具有终止脂肪酸延长而形成中链脂肪酸的转移酶活性，对于兔、鼠等非反刍动物则由独立于脂肪酸合酶的硫酯酶Il（Thioesterase Il，TEIl）来完成此功能。而反刍动物和非反刍动物在短链脂肪酸的合成中，乙酰辅酶A（CoA）和丙二酸单酰基CoA都是通过MAT的活性转载进人脂肪酸合成的循环过程中。
研究表明，MAT的过表达导致FASN的表达量显著上升，表明MAT参与脂肪酸代谢调控。由此可以推断，山羊MAT对羊乳短、中链脂肪酸的合成起着重要的调控作用，但其具体机制尚需进一步验证。
Grunnet等首次在山羊上证实了MAT不仅具有转移酶活性，而且具有硫酯酶活性。Rangan等克隆了大鼠FASN中的MAT并在大肠杆菌中表达，分离得到的重组蛋白具有催化活性，并对MAT进行了定点突变，确定其关键位点为Ser581、His683。在大肠杆菌中，MAT是以包涵体的形式存在的，将其复性后，MAT蛋白具有转移酶活性。
本试验通过构建pET32a（+）-MAT原核表达载体，利用大肠杆菌菌株表达重组MAT蛋白，检测复性后纯化蛋白的活性，同时免疫家兔制备多克隆抗体，分析多克隆抗体的效价及专一性，以期为进一步研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供试验材料。
MAT蛋白的表达和纯化
pET32a（+）-MAT转人大肠杆菌BL21（DE3）中，挑取单克隆培养至对数生长期时，加IPTG至终浓度1mmo1/L，37℃诱导表达4h。4℃、6000r/min离心10min收集菌体。试验同时设立未进行诱导的pET32a（+）、pET32a（+）-MAT和诱导的pET32a（+）为对照。对菌体进行SDS-PAGE电泳分析，并以抗His标签的单抗作为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，进行Western blot分析。
菌液分别采用不同的温度（25，30，37℃）、诱导剂IPTG浓度（0.1，0.5，1.0，1.5，2.0mmo1/L）及不同的收菌时间（2，4，6，8h）进行诱导，通过对比确定出最佳表达条件。收集此条件下诱导表达的菌体，采用冰上超声破碎法破碎菌体，超声条件如下：功率300W，超声5s停7s为一个循环，共进行50个循环。超声破碎后分离上清与沉淀，进行SDS-PAGE检测。收集2L诱导表达后的菌体，超声波破碎后收集沉淀部分，用包涵体洗液洗涤3次后，将沉淀溶解于含有8mo1/L尿素的裂解缓冲液，上清液经过滤后用AKTA TM Purifier纯化。Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱用5倍柱体积的平衡缓冲液（8mo1/L尿素、20mmo1/L咪唑、0.5mo1/L NaC1、20mmo1/L KH2PO4）平衡，上样流速0.5mL/min，然后用10倍柱床体积的平衡缓冲液洗柱子，最后用洗脱缓冲液（8mo1/L尿素、500mmo1/L咪唑、0.5mo1/L NaCl、20mmo1/L KH2PO4）洗脱目的蛋白。
多克隆抗体的制备
将1mL纯化的融合蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后，采用皮下6点注射法免疫新西兰大耳白兔；15d后，取1mL融合蛋白与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化后加强免疫；第30和40天分别用不加佐剂的纯化蛋白1mL加强免疫。第4次免疫10d后采全血，分离抗血清，80℃保存。
讨论
Rangan等克隆了大鼠的MAT基因，将其在大肠杆菌中表达、纯化，发现分离得到的重组蛋白具有催化活性。本试验将纯化的山羊MAT蛋白复性后，参照Joshi等的方法进行酶活分析，结果表明，纯化的MAT可以催化乙酰CoA生成CoA，这与Rangan等的研究结果一致，表明原核表达的MAT重组蛋白具有催化活性。本试验选择pET32a(+)作为表达载体，不仅由于其具有很强的T7噬菌体转录系统，同时该载体含有C端、N端2个His标签，可增强重组蛋白与Ni-NTA琼脂糖亲和介质的结合力，便于之后的纯化。在优化条件下，重组MAT蛋白在大肠杆菌中高效表达，由于难以正确折叠而导致蛋白质聚集从而形成包涵体。对MAT目的蛋白进行SDS-PAGE鉴定时，预计的目的蛋白分子质量大小与蛋白Marker指示的实际大小有偏差，这可能是由于该蛋白氨基酸的等电点以及电泳缓冲液的pH影响所致。为保证制备的抗体具有较高的效价，将纯化的蛋白梯度透析去除尿素，使目的蛋白最大程度复性。对于制备的多克隆抗体，确定其特异性对该抗体的应用非常关键。本试验同时使用原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白，通过Western blot检测MAT多克隆抗体的专一性。结果表明，无论是原核表达的MAT蛋白还是真核表达的MAT蛋白，都只出现1条特异性条带，说明制备的MAT多克隆抗体具有非常好的特异性。
综上所述，本研究获得了有活性的MAT蛋白，成功制备了高效价、高特异性的兔抗羊MAT多克隆抗体，这为进一步研究MAT在短、中链脂肪酸形成过程中的调控作用机理提供了可靠的工具。
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201411081133.html
(by admin)
研究表明，MAT的过表达导致FASN的表达量显著上升，表明MAT参与脂肪酸代谢调控。由此可以推断，山羊MAT对羊乳短、中链脂肪酸的合成起着重要的调控作用，但其具体机制尚需进一步验证。
Grunnet等首次在山羊上证实了MAT不仅具有转移酶活性，而且具有硫酯酶活性。Rangan等克隆了大鼠FASN中的MAT并在大肠杆菌中表达，分离得到的重组蛋白具有催化活性，并对MAT进行了定点突变，确定其关键位点为Ser581、His683。在大肠杆菌中，MAT是以包涵体的形式存在的，将其复性后，MAT蛋白具有转移酶活性。
本试验通过构建pET32a（+）-MAT原核表达载体，利用大肠杆菌菌株表达重组MAT蛋白，检测复性后纯化蛋白的活性，同时免疫家兔制备多克隆抗体，分析多克隆抗体的效价及专一性，以期为进一步研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供试验材料。
MAT蛋白的表达和纯化
pET32a（+）-MAT转人大肠杆菌BL21（DE3）中，挑取单克隆培养至对数生长期时，加IPTG至终浓度1mmo1/L，37℃诱导表达4h。4℃、6000r/min离心10min收集菌体。试验同时设立未进行诱导的pET32a（+）、pET32a（+）-MAT和诱导的pET32a（+）为对照。对菌体进行SDS-PAGE电泳分析，并以抗His标签的单抗作为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，进行Western blot分析。
菌液分别采用不同的温度（25，30，37℃）、诱导剂IPTG浓度（0.1，0.5，1.0，1.5，2.0mmo1/L）及不同的收菌时间（2，4，6，8h）进行诱导，通过对比确定出最佳表达条件。收集此条件下诱导表达的菌体，采用冰上超声破碎法破碎菌体，超声条件如下：功率300W，超声5s停7s为一个循环，共进行50个循环。超声破碎后分离上清与沉淀，进行SDS-PAGE检测。收集2L诱导表达后的菌体，超声波破碎后收集沉淀部分，用包涵体洗液洗涤3次后，将沉淀溶解于含有8mo1/L尿素的裂解缓冲液，上清液经过滤后用AKTA TM Purifier纯化。Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱用5倍柱体积的平衡缓冲液（8mo1/L尿素、20mmo1/L咪唑、0.5mo1/L NaC1、20mmo1/L KH2PO4）平衡，上样流速0.5mL/min，然后用10倍柱床体积的平衡缓冲液洗柱子，最后用洗脱缓冲液（8mo1/L尿素、500mmo1/L咪唑、0.5mo1/L NaCl、20mmo1/L KH2PO4）洗脱目的蛋白。
多克隆抗体的制备
将1mL纯化的融合蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后，采用皮下6点注射法免疫新西兰大耳白兔；15d后，取1mL融合蛋白与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化后加强免疫；第30和40天分别用不加佐剂的纯化蛋白1mL加强免疫。第4次免疫10d后采全血，分离抗血清，80℃保存。
讨论
Rangan等克隆了大鼠的MAT基因，将其在大肠杆菌中表达、纯化，发现分离得到的重组蛋白具有催化活性。本试验将纯化的山羊MAT蛋白复性后，参照Joshi等的方法进行酶活分析，结果表明，纯化的MAT可以催化乙酰CoA生成CoA，这与Rangan等的研究结果一致，表明原核表达的MAT重组蛋白具有催化活性。本试验选择pET32a(+)作为表达载体，不仅由于其具有很强的T7噬菌体转录系统，同时该载体含有C端、N端2个His标签，可增强重组蛋白与Ni-NTA琼脂糖亲和介质的结合力，便于之后的纯化。在优化条件下，重组MAT蛋白在大肠杆菌中高效表达，由于难以正确折叠而导致蛋白质聚集从而形成包涵体。对MAT目的蛋白进行SDS-PAGE鉴定时，预计的目的蛋白分子质量大小与蛋白Marker指示的实际大小有偏差，这可能是由于该蛋白氨基酸的等电点以及电泳缓冲液的pH影响所致。为保证制备的抗体具有较高的效价，将纯化的蛋白梯度透析去除尿素，使目的蛋白最大程度复性。对于制备的多克隆抗体，确定其特异性对该抗体的应用非常关键。本试验同时使用原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白，通过Western blot检测MAT多克隆抗体的专一性。结果表明，无论是原核表达的MAT蛋白还是真核表达的MAT蛋白，都只出现1条特异性条带，说明制备的MAT多克隆抗体具有非常好的特异性。
综上所述，本研究获得了有活性的MAT蛋白，成功制备了高效价、高特异性的兔抗羊MAT多克隆抗体，这为进一步研究MAT在短、中链脂肪酸形成过程中的调控作用机理提供了可靠的工具。
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201411081133.html
(by admin)
2014-11-08