纽普生物

LncRNA的研究进展(肌肉发育相关)

?????? 2010 年之前,基因表达调控的研究主要集中在转录因子介导的基因转录调控,尤其是与编码蛋白质的基因,它们约占整个基因组的2%。RNA 一度被认为是DNA 和蛋白质之间的“过渡”,但越来越多的证据表明,RNA 在生命进程中扮演的角色远比人们设想的多。最近发现的长链非编码RNA(long noncodingRNA,LncRNA)和小分子非编码RNA(small noncoding RNA),包括piRNA(piwi-interacting RNA),hsRNA(heterochromatin associated small RNA),esiRNA(endogenous siRNA)和microRNA(miRNA)等,分别在转录水平、转录后水平及表观遗传等方面控制基因的表达, 组成了RNA 调控网络,在干细胞维持、细胞增殖和分化、信号转导、代谢、个体发育等几乎所有关键生命活动中发挥重要的调控作用,并与多种人类重大疾病的发生密切相关,如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、病毒感染等。这些非编码RNA 的发现,揭示了真核生物一种新的表达调控方式,使非编码RNA 成为后基因组时代一个重要的生命科学研究前沿。《Times》评选出的2012 年度十大生命科学突破,垃圾RNA 备受瞩目;2012 年度《Cell》评选出的12 篇最佳论文,RNA 领域“独中两元”:“diRNA(DSB-induced small RNA)在真核生物DNA双链断裂修复过程中具有保守的修复功能”和“piRNAs 在线虫生殖细胞中诱导多代表观遗传沉默途径”;2012 年度《Nature》封面有4 篇RNA 报道;2012 年度《Science》封面故事RNA 领域有4篇文章。截至2012 年12 月《Cell》、《Nature》和《Science》关于RNA 领域的论文有 520 余篇,而且还在持续增加中。在众多RNA 领域的研究中,LncRNA 引起了人们极大关注。是2012 年度兴起的生命科学前沿之前沿。LncRNA 在众多生命活动中起着举足轻重的作用,是继mRNA、mirRNA 之后当今分子生物学最热门的研究领域之一。《Cell》报道LncRNA 分子对于肌肉发育和肌肉疾病具有重要调节作用。随着对LncRNA功能的深入研究,探讨LncRNA 在个体发育、物种进化、疾病发生和组织细胞分化中的重要作用,从DNA、RNA 和蛋白质三个方面揭示肌肉生长发育的复杂分子网络机制。

?????? LncRNA 是一类长度大于200 个nt不表现蛋白质编码潜能的RNAs。参与基因组印记、X 染色体沉默以及染色质修饰、核内运输、转录干扰、转录激活等多种重要的调控过程,涉及到表观遗传调控、转录调控及转录后调控等多个层面。LncRNA的表达水平相对于编码蛋白基因比较低, 说明LncRNA 可能主要起调控作用。根据LncRNA 在基因组上的位置,一个LncRNA 可以归于以下5 类中的1种或5 种:正义链(sense)、反义链(antisense)、双向(bidirectional)、内含子间(intronic)、基因间(intergenic)。

1 国外 LncRNA 与肌肉发育研究进展
?????? 1990 年发现了经典LncRNA,H19 印迹基因和X染色体失活特异性转录因子( X-inactive- specifictranscript, XIST)。2002 年在对小鼠全长互补DNA(cDNA)文库的大规模测序中发现了转录物LncRNA。LncRNA不仅在特定的发育阶段出现,或具有组织或细胞特异性,还有很多LncRNA 具有保守的剪切形式、二级结构以及精确的亚细胞定位。随着LncRNA 功能的深入研究,人类基因组中约93% 的序列可被转录,而占转录组98% 的是无蛋白质编码功能的非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA),具有蛋白质编码功能的转录物不超过2%.

斑马鱼胚胎发育过程中,与蛋白编码基因相比,LncRNAs 在相对狭窄的时间窗中表达,在胚胎早期特别丰富。某些lncRNAs 的表达具有组织特异性,并具有独特的亚细胞定位模式。LncRNA 具有复杂的二级和三级结构,这赋予LncRNA 特殊的结合功能。如LnRNA repA 与PRC2 结合是通过形成带有4 个发夹结构的二聚体实现的 ;LncRNA-Gas5 的发夹结构能够诱导糖皮质激素受体远离其在DNA 上的靶点,假如没有发夹结构,糖皮质激素将影响Gas5 与DNA的结合和转录抑制功能。对LncRNA 组织表达和结构的不断深入研究,人们发现LncRNA 参与生长发育、分化、细胞凋亡等重要过程。

1.1 LncRNA 分子可以在不同区域结合不同的蛋白复合物,动态控制与生长发育相关基因Daphne 等研究发现,DBE-T 是一种与染色质相关的长链非编码RNA,在FSHD 患者中选择性产生,可招募Trithorax 家族蛋白Ash1L 到FSHD 位点,驱动组蛋白H3 赖氨酸36 甲基化及染色质重塑,调节4q35 基因的抑制及转录,使D4Z4 重复序列拷贝数量减少而导致患者面肩肱肌萎缩。另外一种LncRNAANRIL(antisense noncoding RNA in the INK4 locus)可作用并调节chromobox7(CBX7),CBX7 结合Polycomb 抑制复合物1(PRC1)和甲基化组蛋白H3赖氨酸27(H3K27),引发表观遗传学沉默,ANRIL与CBX7相互作用使PRC1基因控制细胞衰老。Hung等证实,当发生DNA 损伤时,p53 结合蛋白周期依赖性激酶抑制因子1A(CDKN1A)基因上的位点,激活LncRNA-PANDA 的表达,LncRNA- PANDA 由于结合了核转录因子Yα 亚基(NFsubunit-YA),进而阻止凋亡α 相关基因的表达,延长细胞的生存时间。另外LncRNA-ANRIL 能上调转录因子(E2F1),抑制INK4a, INK4b 和ARF 等DNA 损伤基因的表达,达到恢复细胞活性的功能。

1.2 LncRNA 通过竞争性结合miRNA,通过对该miRNA转录后的调控影响肌肉生长发育最近研究发现,LncRNAs 能够竞争性地与其它非编码RNAs 结合(包括 microRNAs),共同调控基因的表达。有一类称为竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)-LncRNA,与miRNA 结合从而阻碍miRNA 对靶基因的作用,保证相应靶基因转录后表达。Cesana 等在研究人和小鼠的骨骼肌生长发育时发现,特异性表达的胞质长链非编码RNAlinc-MD1 可发挥ceRNA 活性,通过结合miR-133 和 miR-135 实现对肌肉特异性基因,即转录调控因子MAML1 和 MEF2C 的表达调控。

1.3 LncRNA 可作为诱饵分子对骨骼肌生长发育和细胞凋亡产生影响生长阻滞特异转录物5(growth arrest-specific transcript 5,Gas5)是哺乳动物肌肉生长和细胞凋亡的关键调控因子。Gas5 通过模拟糖皮质激素应答元件来结合糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor)的DNA 结构域,阻止糖皮质激素受体与糖皮质激素应答元件的相互作用,从而抑制下游基因的表达,促进细胞凋亡。Huarte 等研究发现,p53 直接诱导长链基因间非编码RNA p21(Long intergenic ncRNA p21,lincRNA-p21)的表达,LincRNA-p21 能够与核不均一核糖核蛋白-K(hnRNP-K)相互作用后可抑制p53 信号通路下游基因的表达,从而调控p53 介导的细胞凋亡。

1.4 LncRNA 可能存在远程调控生长发育机制LncRNA IGF2R 反义RNA(antisense of IGF2RRNA, AIR)、XIST 等是通过招募形成染色质修饰复合物而沉默邻近基因转录,同源异型基因(HOX)在细胞增殖与定向分化中起关键作用。Hox 基因反义基因间RNA(HOTAIR)的发现提示,LncRNA 可能存在远程调控肌肉生长发育的作用,其中HOTAIR定位于HOXC 基因座12q13.13 ,HOTAIR 的5'端可招募结合多梳蛋白抑制复合2(PRC2),借助PRC2上3 个H3K27 甲基化酶SUZ12、EED 和EZH2 ,使另一基因座HOXD 上长约40 kb 的序列转录沉默,从而调节染色质和转录,进一步影响增殖和分化基因的表达。LncRNA 的远程调控机制在生物体内广泛存在,超过20% LncRNA 能够通过结合PRC2 或其它类似复合物而发挥作用。

1.5 LncRNA 作为印记基因在生长发育中起重要作用占人类基因组不到5%的印记基因,在胚胎发育过程、胎儿生长发育及出生后的生长起着关键的调节作用。H19 等多种LncRNA 参与了基因印记。LncRNA H19 是miRNA-675 前体,在胚胎组织中H19转录水平高,呈母源表达,出生后下调。在胚胎发育期,同一发育阶段的相同组织中,这两种基因的表达模式是相似的,受到共调控。IGF2 在脊椎动物中高度保守的一种重要的生长因子。在大多数胚胎组织中,H19 和IGF2 呈现单等位基因表达 (monoallelicexpression),两者之间存在印记控制区(imprintingcontrol region,ICR),在母源染色体上,H19 与转录因子 CTCF(CCCTC-binding factor)结合,阻断下游增强子对 IGF2 的结合,促进 H19 的表达;在父源染色体上,下游增强子只与 IGF2 启动子结合而不与H19 启动子结合,促进 IGF2 的表达,抑制 H19 的表达,H19 存在双向调节功能,Leighton 等在缺乏H19 的畸胎瘤小鼠模型中发现了胚胎生长过快的现象,说明H19 具有抑癌作用。LncRNA 基因Xist 与HOTAIR 具有相似的机制,能够招募并结合PRC2 来介导基因沉默。哺乳动物X 染色体失活是由约17 kb 的lncRNA-X ist 顺式作用介导。X 失活中心(X inactivation center,Xic)控制 2 条 X 染色体中的一条染色体沉默,从而维持剂量补偿效应。RepA 在调控X 染色体失活中发挥关键作用,RepA(Xist RNA 上的一个1.6 kb 片段)可募集Polycomb 抑制复合物2(polycomb repressivecomplex 2, PRC2),如果激活Xist 基因座转录,Xist和PRC2 就沿着X 染色体进行扩展,过表达的Xist通过RepA 序列结合更多的PRC2,使X 染色体组蛋白H3K27 发生广泛性三甲基化,覆盖了该条染色体的关键位点,使染色体H3K27 发生甲基化,通过EZH2靶向将被失活的染色体,导致X 染色体重构而失活,进而调节基因的增殖和分化。同样Tsix 是Xist的反义转录物,为了阻止RepA 招募PRC2,Tsix 与RepA 竞争性结合PRC2,作为Xist 的拮抗产物参与X 染色体失活的调控。

1.6 家畜 LncRNA 的研究处于起步阶段Huang 等利用已公布的牛特定的表达序列标签,通过特征分析在405 个基因间隔区筛选出449 种LncRNA,这些LncRNAs 具有组织表达特异性,在哺乳动物中比较保守,其中GC 含量高于随机选择的基因间序列。最近在猪的胎儿滋养层鉴定出一种新的长链非编码RNA,通过染色体定位和二级结构分析,发现这种LncRNA 在猪胎儿骨骼肌中表达上调,对猪胎儿骨骼肌的发育有显著影响 。Li 等 运用RNA-seq 技术和生物信息学分析方法,在鸡基因组中鉴定出281 种新的LncRNAs,与鸡骨骼肌发育相关,而且保守性低于编码基因序列,这与Huang 等的研究结果一致。

2 国内畜禽 LncRNA 及肌肉发育调控的研究进展
?????? 在国内,关于LncRNA 的研究主要集中在人类疾病,仅限于人和小鼠等为数不多的生物 LncRNA 的筛选,大部分停留在寻找鉴定新的LncRNA,功能方面有待进一步深入研究。未见动物生长发育方面的研究报道。孙树汉等发现一个与肝癌有关的LncRNA LET,受靶分子HDAC3 抑制调控的LncRNA-LET 参与低氧诱导的癌细胞转移。王富博等发现血浆长链非编码RNA(MD- miniRNA),可用于前列腺癌的早期诊断。Qian 等利用芯片法研究大鼠坐骨神经缺损后背根神经节中LncRNA 的表达变化,筛选出24 个显著下调的LncRNAs , qRT-PCR 检测的LncRNAAF130881 和AB020616 的表达变化与芯片一致,得到与LncRNA AF130881 和AB020616 正向或负向共表达的蛋白编码基因25 个。Cao 等使用脂质体介导小干扰RNA(siRNA)转染前列腺癌LNCaP 细胞,发现长链非编码RNA(PCA3)在前列腺癌LNCaP 细胞株中能抑制前列腺癌细胞增殖,PCA3 通过调节细胞增殖促进前列腺癌发展,有望成为前列腺癌新的治疗靶点。
?????? 殷庆飞等发现了一种新LncRNA,命名为sno-LncRNAs,是一类双末端都含有小核仁RNA(snoRNA)的内含子序列在剪接过程中形成的,在人源胚胎干细胞中表达量极高,且异常稳定。人类疾病Prader-Willisyndrome(小胖威利症)紧密关联区域存在5 个sno-LncRNAs,同时还发现含有多个剪接调控因子Fox2 蛋白的特异结合位点,这些位点影响Fox2 对特异mRNA 底物的选择性剪接调控。

3 展望
?????? 研究方法的建立和应用至关重要。目前 LncRNA研究方法主要有以下几种:转录组测序、微阵列、实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应、Northern 印迹、RNA 干扰荧光原位杂交和 RNA 结合蛋白免疫沉淀等。随着LncRNA 研究技术的进步,将有更多的新技术运用于 LncRNA 的功能研究中,有助于进一步解析 LncRNA 的功能及其分子调控机制,在疾病发生、发展中的病理机制。深入探讨 LncRNA 调控生肌因子进而调节肌肉发育分化,避开蛋白-蛋白调控通路的思路,以全新的视角阐释哺乳动物生肌分子机制,寻找与生长发育有关的新LncRNA 分子,对LncRNA 分子及其靶基因的生物学功能进行深入研究,是今后研究的方向。


原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201410311132.html

(by admin)

2014-10-31