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Znf230多克隆抗体的制备及其在小鼠组织中的表达

【摘要】 目的 通过获得小鼠Znf230多克隆抗体,对Znf230在小鼠组织中的表达及定位进行研究。方法 扩增小鼠Znf230基因与原核表达载体pGEX-5X-3重组,诱导得到GST-Znf230融合蛋白,纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,通过Western blot和免疫组织化学方法研究Znf230在小鼠组织中的表达及定位情况。结果 Znf230多克隆抗体具有较高的特异性,Znf230在小鼠多种组织中均有表达,在脾脏和脑组织中表达量较高,该蛋白在肝细胞、脾细胞、肺支气管上皮细胞细胞核中表达,在肾小管上皮细胞的细胞质中表达,在睾丸组织精子细胞的顶体系统表达。结论 成功获得小鼠Znf230多克隆抗体,证实Znf230在小鼠多种组织中表达,它可在肝细胞、脾细胞、肺支气管上皮细胞核及肾小管上皮细胞质中表达,也可在精子细胞的顶体系统表达。

锌指蛋白基因家族为哺乳动物最大的基因家族之一,环指蛋白为该基因家族的一个亚类,具有特征性的C3HC4型或C3H2C3结构域。迄今为止,已有200多种环指蛋白参与了细胞周期、信号转导、RNA转运、转录调控、肿瘤生成和其他的发育过程。ZNF230是我室2001年克隆的一个可能与人类精子发生相关的基因, 小鼠同源基因Znf230 与人
ZNF230 核苷酸和蛋白序列的同源性分别为92%、98%,锌指结构域完全相同。ZNF230/Znf230属于C3HC4型锌指蛋白, 大多数的C3HC4型锌指蛋白均为核内转录因子。先前研究表明,ZNF230/Znf230可以在Cos7细胞核中表达,ZNF230能够在HepG2细胞核中表达,是具有DNA结合能力的蛋白因子, 提示该基因在生精调控中具有转录因子的某些特性。ZNF230/Znf230上游序列具有启动子功能,5’上游CpG岛非甲基化对该基因表达是必要的。ZNF230基因不但与无精症相关,而且可能与血清FSH水平有相关性。另有研究表明, ZNF230与HIV/HCV合并感染及HCV感染可能存在一定相关性。尽管得到以上结论,但是Znf230 表达的细胞定位尚未阐明,直观展示Znf230 在组织中的表达及亚细胞定位有利于进一步研究该基因的正常功能及其在生精过程中的作用。因此本实验我们首先制备小鼠Znf230 多克隆抗体,并且观察该基因在小鼠组织中的表达及定位情况,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

多克隆抗体的制备及特异性鉴定
pGEX-Znf230转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。超声破碎菌体,离心,收集沉淀和上清分别进行SDS-PAGE电泳。用Glutathione Sepharose 4B亲和纯化裂解液上清中的融合蛋白,融合蛋白进行透析和浓缩后,与弗氏佐剂乳化后皮下注射家兔,每隔2周加强1次免疫,共加强4次,从第3次免疫后1周ELISA法测定血清抗体效价,末次免疫后2周进行心脏采血,分离血清,-70℃保存。纯化的融合蛋白电泳转膜,加入1:5000稀释的抗血清(免疫前血清作为阴性对照),室温孵育2 h后加入1:7 500稀释的HRP标记的羊抗兔IgG,室温孵育1 h, ECL显色后曝光。

讨论
ZNF230 基因是我室通过对无精症患者与可育成人睾丸组织mRNA 差异显示分离克隆出的可能与人类精子发生相关的新基因。随后获得了小鼠Znf230 基因,它编码一个230 个氨基酸的C3HC4 型锌指蛋白。小鼠Znf230 基因是人ZNF230 基因的同源基因。鉴于直接研究人类ZNF230 蛋白的表达取材比较困难,本研究首先对小鼠组织中Znf230 基因的表达进行研究,以期对人类ZNF230 基因的深入研究提供线索。
制备一种效价高、特异性好的抗体,对于研究基因的表达、定位等生物学功能是必不可少的。本实验通过PCR 扩增获得小鼠Znf230 基因并且与原核表达载体进行重组,将重组质粒转入大肠杆菌,IPTG诱导4 h 时,重组蛋白表达量最大,并且主要以可溶形式表达,纯化的融合蛋白免疫家兔,制备出高效价和高特异性的多克隆抗体。随后通过 Westernblot 检测发现Znf230 在成年小鼠不同组织中均有不同程度的表达,在脾脏和脑组织中表达量较高。免疫组织化学分析结果表明Znf230 在肝细胞、脾细胞、肺支气管黏膜上皮细胞的细胞核中表达,在肾小管上皮细胞的细胞质中表达,在睾丸组织圆形精子细胞和延长精子细胞的顶体系统表达。虽然我们以前预测该蛋白核定位可能性为60%,ZNF230/Znf230 可在Cos7 和 HepG2 细胞核中表达,但是通过本实验,我们发现Znf230 在不同组织表达的部位不同,可在细胞核或者细胞质中表达,另外,Znf230 在精子细胞的顶体系统表达提示该蛋白可能在小鼠精子的生成特别是精子顶体的形成、受精过程中起着重要的作用。
总之,本课题组克隆了小鼠Znf230 基因,并制备了Znf230 的多克隆抗体,抗体具有高度特异性,可用于Western blot 和免疫组织化学检测,为进一步研究该基因的功能提供了抗体;同时初步研究了Znf230 在小鼠组织中的表达及定位情况,对于深入研究其功能具有重要的提示意义。


原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201410311129.html

(by admin)

2014-10-31