纽普生物

猪磷酸酪氨酸互作结构域1基因的融合表达及其多克隆抗体的制备

摘要:本文旨在通过原核表达获得猪磷酸酪氨酸互作结构域1(pPID1)重组蛋白,并制备pPID1多克隆抗体。将pPID1基因插入pET28a(+),构建重组pET28a(+)-pPID1大肠杆菌表达质粒,然后将重组质粒pET28a(+)-pPID1转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,获得的重组子以不同异丙基硫代--D-半乳糖苷(IPTG)浓度、温度和时间诱导,确定pPID1融合蛋白表达的最适条件。将表达产物经镍离子-亚氨基二乙酸(Ni2+-IDA)亲和层析纯化后进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MSMS)鉴定。同时,将纯化获得的pPID1融合蛋白免疫SD大鼠,制备pPID1多克隆抗体,并检测抗体效价。结果表明:pPID1融合蛋白表达的最佳条件为30℃以0.1mmol/LIPTG诱导4h;纯化的融合蛋白经MALDI-TOF-MSMS鉴定为pPID1;特异性的pPID1多克隆抗体成功制备,抗体效价为1∶20480。本试验成功制备了高纯度的重组pPID1及其多克隆抗体。

磷酸酪氨酸互作结构域1 phosphotyrosinein-teraction domain containing 1 PID1基因是Wang等于2006年采用抑制性消减杂交技术筛选肥胖与正常人腹膜脂肪组织后而获得的新基因。该基因最先命名为NYGGF4基因,后根据该基因的结构特征被国际统一命名为PID1基因。基于生物信息学分析发现PID1蛋白序列中存在磷酸酪氨酸作用位点PTB,该位点与胰岛素受体底物-1IRS1的结构相似,参与胰岛素信号途径的调节和生长因子刺激下细胞增殖等下游效应生物学功能。研究表明PID1与胰岛素抵抗和人类肥胖病的发生密切相关,另有研究表明PID1基因在鼠脂肪组织中也呈高水平表达。在脂肪细胞增殖和分化成熟过程中其表达也逐渐上调。此外PID1基因在体外过表达能显著促进小鼠3T3-L1脂肪前体细胞的增殖和脂肪细胞数目的增多,而脂肪细胞过度增殖是脂肪沉积发生的重要环节。前人对PID1基因的研究主要以人和鼠为对象,对猪PID1基因的研究较少。钱源等首次采用简并引物克隆到猪PID1基因的编码序列CDS蛋白结构域分析发现该序列C端也含有一PTB结构域与IRS1中PTB结构域的结构相似提示其可能有相似的功能,组织表达规律研究表明猪PID1基因呈多组织表达特性并在猪的肝脏中表达量最高其次为脂肪和肌肉组织。PID1基因在地方品种猪莱芜猪和鲁莱黑猪中的表达均显著高于大白猪,而莱芜猪和鲁莱黑猪肌内脂肪含量显著高于大白猪。相关性分析结果表明肌肉组织中PID1基因表达量与猪肌内脂肪含量呈显著正相关,且莱芜猪PID1基因与肌内脂肪含量的相关性高于过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR。另有研究表明,过表达猪PID1能显著促进3T3-L1前体脂肪细胞的增殖,而对其分化影响差异不显著。上述结果提示PID1基因能影响脂肪沉积并与猪肌内脂肪含量间存在一定的关联性可能为影响猪肌内脂肪沉积的候选基因。目前对猪PID1基因的功能和组织表达规律研究仅限于在其mRNA水平上研究,因此为从蛋白质水平上鉴定猪PID1的功能猪PID1蛋白的抗体制备就显得非常必要。本研究旨在利用原核表达系统制备重组猪PID1蛋白,并采用镍离子-亚氨基二乙酸Ni2+-IDA亲和层析柱对其进行纯化。纯化的蛋白采用十二烷基硫酸钠-变性梯度凝胶电泳SDS-PAGE和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱MALDI-TOF-MSMS进行鉴定,同时制备猪pPID1的多克隆抗体为深入研究猪pPID1的功能及猪PID1的检测提供试验材料。

多克隆抗体的制备
用纯化的pPID1融合蛋白常规免疫SD大鼠,每次免疫剂量200ug(溶于PBS中)。首次免疫将纯化得到的猪PID1蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化对SD大鼠背部皮下多点注射,2周后以同样的抗原剂量与等体积的弗氏不完全佐剂混合免疫,此后每隔10d进行加强免疫1次共加免3次,最后1次免疫后7天摘眼球采血制备血清,SD大鼠免疫前进行尾根断尾取血清作为阴性对照。


原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201410311128.html

(by admin)

2014-10-31