手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)是一种地方流行病,主要发病人群为儿童,重症患者可表现为脑炎,无菌性脑膜炎等多种与神经相关的疾病。手足口病的其中一种主要 的病原体是肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71),1969年在美国加利福尼亚首次分离出EV71,它是小RNA病毒病毒科的一员,无包膜,其基因组为一条大小约为7.4kb的正义单链 RNA。EV71型病毒基因组编码四个结构蛋白,分别为VP1、VP2、VP3、和VP4,构成原聚体,该原聚体再拼装成具有五聚体样结构的亚单位 (pentameric unit),60个亚单位通过各自的结构域相互连接,最终形成病毒的外壳,基因组RNA则被包裹在病毒外壳内。VP1、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒 外壳的表面,而VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接,因而抗原决定簇基本上位于VP1-VP3上。虽然该病毒的主要抗原决定区位于VP1,但 VP2、VP3和VP4上也有抗原抗体的结合功能。
自1969年首次报道以来,肠道病毒EV71引起的手足口病是幼儿和儿童常见的一种疾病,严重时会引起患者的死亡。在台湾,EV71导致的传染病曾 多次爆发,1998年死亡78人,2000年死亡25人,2001年和2008年分别死亡26人和14人。近年来,该疾病的流行在国内甚至是全球范围内有 上升趋势,在中国的流行情况最为严重。但是目前为止,临床上对EV71的感染以对症治疗为主,尚没有找到有效的抗病毒的疫苗和药物,所以,对EV71的疫 苗和药物的研究一直都是EV71的研究热点。
有些肠道病毒,例如脊髓灰质炎病毒,结构蛋白最开始切割成3个蛋白,分别为VP0,VP1和VP3,而后VP0可进一步被切割成VP2和VP4,这 个过程对于病毒粒子的成熟起着至关重要的作用。由于EV71的VP2和VP4上也有抗原抗体的结合功能,所以本研究主要表达了这2个结构蛋白。由于VP4 蛋白比较小,本研究将其与VP2整合在一起进行大肠杆菌表达并纯化,将其命名为VP0。本文通过重组表达EV71的结构蛋白VP0,并制备其多克隆抗体,为后续的EV71诊断试剂的研制和病毒研究提供了手段。
1 材料与方法
1.1实验材料、试剂和引物
质粒pET-30a(+)、大肠杆菌TG1、Rosetta(DE3)、Vero细胞、EV71cDNA均由本实验室保存。核酸、蛋白分子量标准购 自上海捷瑞生物工程有限公司,Taq DNA聚合酶、限制性内切酶购自Fermentas公司;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自爱思进生物技术(杭州)有限公司。His-tag单克隆抗体 为本室制备,胎牛血清购自HyClone公司,DMEM培养基购自invitro-gen公司,羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-FITC购自 Santa Cruz公司。其他试剂为国产分析纯。本实验利用Primer Premier 5共设计了一对引物,均由上海捷瑞生物工程有限公司合成,名称及序列如下:
VP0F:5'-CGGGATCCATGGGTTCACAGGTGTCCAC-3'
VP0R:5'-CCCAAGCTTTTGCGTGACTGCTTGCCT-3'
1.2目的基因的扩增
EV71cDNA克隆于pBluescript IISK(+),由本室从广州地区具有脑炎并发症的手足口病的患儿中分离并克隆得到,全基因序列见Gene Bank accession No:FJ360544。VP0的扩增反应体系与条件:50μL反应体系中,加入dNTP、PCR缓冲液、上下游引物,质粒 pBluescriptIISK(+)-cD-NA和TaqDNA聚合酶,混匀后,先以94℃变性5min,然后94℃反应30s,50℃反应 30s,72℃反应60s,30个循环,最后72℃延伸10min。
1.3表达载体的构建
目的基因VP0经DNA聚合酶特异性扩增后,用琼脂糖凝胶电泳进行检测,再用核酸纯化试剂盒回收后用BamHI/HindI-II限制性内切酶进行 双酶切,与经BamHI/HindIII限制性内切酶双酶切消化后回收的pET-30a(+)载体用T4DNA连接酶,16℃水浴过夜连接,转化感受态 E.coliTG1菌株,涂布于LB平板上(含卡那霉素),37℃培养过夜。菌落PCR鉴定,将阳性菌落接种于3mL新鲜的LB培养基中(含卡那霉素), 提取质粒,用限制性内切酶进行双酶切鉴定。将上述阳性克隆质粒转化到表达菌株Rosetta(DE3)感受态细胞中,并涂布到含有卡那霉素和氯霉素的平板 上过夜培养。挑取单个克隆分别命名为Rosetta(DE3)/pET-30a(+)-VP0。
1.4重组蛋白诱导表达及SDS-PAGE鉴定
挑取过夜培养的克隆,接种到3mL含卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养。次日,按体积比1:20的比例接种到3mL含对应抗生素的 LB液体培养基中,37℃培养大概2~2.5个小时至OD达到0.6,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,诱导表达4小时后10000rpm离心 1min收集菌体。菌体用600μL0.02mol/LPBS(pH7.8)重悬后在冰浴中进行超声波破碎。12000r/min离心5min后,取上清 90μL。沉淀再用600μL0.02mol/L的PBS(pH7.8)悬起混匀,取样90μL。加4×SDS上样缓冲液30μL,煮沸5min后进行 10%的SDS-PAGE分析,检测诱导表达的蛋白。同时用转化了空载体的重组菌作为对照。
1.5 表达蛋白的纯化
大量诱导蛋白的表达:条件和小量诱导相同,将体积扩大到1LLB的液体培养基。诱导结束后,将培养物4000r/min,离心20min,收集菌 体,用磷酸缓冲液(0.02mol/LPBS,pH7.8)缓冲液洗涤一次后重悬,置冰浴中超声破菌。将裂解液在4℃,10000r/min,离心 10min,去上清,收集到的沉淀即为粗制包涵体。制得的包涵体用0.5% Triton X-100洗涤一次,10000r/min,离心10min,弃上清,收集的沉淀用含6mol/L盐酸胍的0.02mol/L PBS(pH7.8)缓冲液溶解离心后备用。Ni2+亲和层析柱用含6mol/L盐酸胍的0.02mol/LPBS(pH7.8)缓冲液平衡,将蛋白液上 样于层析柱,分别用含50、100、200mmol/L咪唑的变性缓冲液(含6 mol/L盐酸胍的0.02mol/L PBS(pH7.8)缓冲液)洗脱,收集样品。取收集的样品90μL加入等体积的10%三氯乙酸,4℃放置30min,12000r/min离心 15min,弃上清,用无水乙醇洗涤沉淀2次,加入1×SDS上样缓冲液,煮沸5min后进行SDS-PAGE分析蛋白纯化结果。
1.6 重组蛋白的WesternBlot检测
将SDS-PAGE凝胶的蛋白带电转移至硝酸纤维素膜,用封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)封闭,37℃温浴1h。TBST(pH7.5)洗涤3 次,加入抗His-tag单克隆抗体(封闭液1:2000稀释),37℃温浴2h,TBST洗涤3次,每次10分钟,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG-HRP(封闭液1:5000稀释),37℃温浴1h,TBST洗涤3次后,ECL显色。以未用IPTG诱导的Rosetta(DE3)/pET- 30a-VP0制备样品做同样处理作为对照。
1.7 多克隆抗体的免疫荧光检测
用上述纯化的VP0蛋白用含6mol/L尿素的0.02mol/L,pH7.8 PB透析后,作为免疫原免疫新西兰大白兔制备VP0多克隆抗体。接种EV71病毒到96孔板培养的Vero细胞中,48h后弃去培养液,用PBS洗涤3 次,加入200μL4%多聚甲醛,室温静置20min;弃掉多聚甲醛,用200μL PBS(pH为7.0)洗涤3次,加入封闭液(含3%BSA、0.4%Triton X-100、10%羊血清的PBS),4℃封闭过夜;PBS洗涤2次。加入VP0多克隆抗体(用封闭液1:200稀释),室温孵育2h,PBS洗涤3次, 加入羊抗兔IgG-FITC(用封闭液1:200稀释),室温避光孵育1h,弃二抗,PBS洗涤3次,最后每孔加入50μLPBS,荧光显微镜下检测荧 光。孵育一抗时,以加入不含VP0多克隆抗体的封闭液为空白对照。
2 结果与分析
2.1 目的基因的扩增及表达载体的构建
VP0的基因片段长度为969bp,图1所示分别为PCR扩增产物和酶切产物,大小和预期相一致。
2.2重组蛋白VP0的表达与纯化
重组大肠杆菌Rosetta(DE3)/pET-30a(+)-VP0经0.5mmol/L IPTG诱导4h后得到表达,纯化的洗脱条件为200 mmol/L咪唑的6mol/L盐酸胍缓冲液。结果如图2,从图上可以看出,和对照组相比,该重组菌在IPTG诱导下表达的目的蛋白主要为包涵体的形式。 通过测序分析发现,目的基因在pET-30a(+)上表达的预期的分子量在加上标签蛋白后理论值大小约为46kDa,和SDS-PAGE结果基本相符合。
2.3 WesternBlot检测重组蛋白
表达的目的蛋白带有His标签,因此用抗His的单克隆抗体对重组蛋白进行WesternBlot鉴定,结果如图3所示,与对照组相比在大小为46kDa处有特异性条带出现,表明该特异性条带为目的蛋白VP0蛋白。
2.4 VP0多克隆抗体的荧光检测
经细胞免疫荧光实验检验,发现该抗体与感染EV71病毒的Vero细胞反应性良好,结果如图4所示,与对照组相比,细胞内有明显可见的荧光,这说明本实验制备的多克隆抗体用于检测天然EV71病毒具有可行性。
3 讨论
多数氨基酸都有一个以上的密码子,通过对大肠杆菌密码子的应用情况的分析表明,一些密码子很少使用。当外源的目的基因mRNA在大肠杆菌中表达,因 为密码子的偏爱性的不同,可能会缺乏某种或某几种的tRNA,直接导致翻译的终止,影响目的蛋白的表达。本实验中,初始使用BL21(DE3)表达菌表达 目的蛋白,结果未见目的蛋明显表达。通过分析发现,VP0基因中总共有33个大肠杆菌稀有密码子,改用大肠杆菌Rosetta(DE3)后,成功地表达了 VP0蛋白。大肠杆菌Rosetta(DE3)是一种可以提供6种稀有tRNA的"通用型表达"大肠杆菌,该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs,可以显著增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。本文表达的VP0重组蛋白的表达形 式主要是包涵体,包涵体用8mol/L尿素溶解时,并不能完全溶解,而用6mol/L盐酸胍溶解时,可以完全溶解(照片略)。表达的重组蛋白末端带有 6×His标签,溶解的包涵体经过镍柱纯化,最后得到纯度较高的蛋白,为后续试验打下基础。
需要指出的是,冯嫣芳等的研究中,同样用大肠杆菌表达了EV71VP0蛋白,该论文用到的表达载体是pET-26b(+),并在大肠杆菌 BL21(DE3)中得到表达。与其不同的是,本研究中用到的表达载体是pET-30a(+),在BL21(DE3)中未见目的蛋白明显表达,而改用 Rosetta(DE3)时,目的蛋白大量表达。产生上述结果的原因可能有以下两点:第一、pET-26b(+)载体上带有一个pelB的引导序列,引导 目的蛋白向菌体周质表达,这可能也有助于目的蛋白的表达;第二、本研究中表达的VP0蛋白的基因是来自本室分离的广州地区手足口病患儿的EV71病毒,可 能与冯嫣芳等研究的EV71分离株之间VP0的稀有密码子存在差异,对表达菌的要求也不相同。
本研究中尝试用纯化蛋白免疫小鼠来制备VP0单克隆抗未出现特异性反应,这使得本研究的单克隆抗体的制备以失败告终。但是用类似的方法制备24株 VP1单克隆抗体时,发现其中对感染EV71的Vero细胞共有5株免疫荧光阳性,1株WesternBlot阳性(另文发表)。产生上述不同结果的原因 可能有以下几点:第一、据现有文献报道,结构蛋白中VP1的抗原性最强,而VP2在病毒表面的暴露程度不够充分,VP4则是包裹在病毒颗粒里面的,所以和 VP1重组蛋白相比,VP0(2+4)重组蛋白的免疫原性更低,制备单克隆抗体时, 筛选到反应性好的单抗的概率低;第二、不同的蛋白作为免疫原制备抗体时,对蛋白的性质要求也不相同。可能用重组VP0蛋白制备单克隆抗体时,需要复性后再 来免疫,或者改用真核系统表达。另外,周世力等的研究表明,在酵母细胞中表达的VP2蛋白可与感染EV71患者的血清发生免疫反应,本实验在此基础上将 VP2和VP4组合在一起表达并将其作为免疫原制备单克隆和多克隆抗体,其中,多克隆抗体与Vero细胞中增殖的天然病毒的具有良好的反应性,这为今后针 对VP0蛋白的EV71的诊断试剂的研究(免疫荧光法)和EV71的研究打下了一定的基础。
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201410281122.html
(by admin)
2014-10-28