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抗体制备常用表达系统

从目前的趋势推断,未来抗体及抗体衍生物分子将占据生物治疗药物的1/3以上。用于治疗用途的单抗药物的生产将会是表达系统的开发及优化的主要驱动力。市场上绝大多数的全长单抗都是用哺乳动物细胞生产的,主要是CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)或者CHO衍生的工程细胞。这个平台已经成熟,通过复杂的筛选过程和通过昂贵培养基的驯化,几乎可以将抗体表达量推向了细胞的生理极限。然而,哺乳动物细胞能否依然保持其优势主导地位,未来依旧不可知。尽管如此,生物仿制药的出现将推动建立低成本、高扩展性的新型表达平台。其他抗体生产手段包括基于植物的系统、非传统的单细胞真核表达系统、甚至体外表达系统,如连续进料的无细胞翻译技术,可能在未来成熟为实用的技术平台。

与此同时,得到抗体的结合结构域及替代性的支架结构正在变得越来越重要。现在有许多新的紧凑结构可供使用,这些产品正在进行临床试验进行测试。其中一个优点是它们能在非哺乳动物细胞如大肠杆菌和酵母中进行生产和纯化。

最适合的表达系统的选择与抗体形式(完整抗体,单价或二价片段)和应用领域(治疗,诊断,实验工具)相关联,但是诸如放大,不同抗体的联合生产 ,翻译后修饰是额外考虑的关键因素。

1.原核系统

细菌表达系统非常适合用于表达单链抗体scFvFab和人工小型抗体,可以表达在细胞内、周质腔及分泌到胞外。

1.1大肠杆菌

蛋白质的一级序列非常大的程度上决定了它能否在大肠杆菌中正确的折叠及保持活性。重组抗体的表达通常是通过在N端融合信号肽,使得蛋白能分泌到大肠杆菌的周质腔,在那里,分子伴侣(Skp,FkpA,DsbA,DsbC)可以辅助Ig结构域的折叠和形成正确的二硫键来稳定结构。

然而, 在大肠杆菌重组蛋白的积累过程中,可能会发生蛋白质降解。缺乏周质腔蛋白酶(DegPPrc)的大肠杆菌宿主菌可以提高2-3倍的Fab产量。在细菌周质腔内表达的有功能的抗体产量也依赖于抗体序列,个体差异非常大。另外,有文献报道,在大肠杆菌trx B gor突变体的细胞质中产生了正确折叠的Fab,在该突变体中,细胞质的氧化还原电位可与哺乳动物内质网相媲美。通过与分子伴侣如Skp共表达,也能提高抗体在细胞质中的表达。除了在周质腔和细胞质内的表达,还有一种方法是将抗体分泌到细胞外,比如使用α溶血素(HlyA)系统的大肠杆菌。

由于技术上的原因,在大肠杆菌周质腔内表达全长抗体被认为是不太可能完成的目标。尽管如此,Simmons等人报道了在大肠杆菌周质内快速和高效表达全长IgG的方法。所制备的抗体的结合活性完全保留,但是也如预期的一样,Fc部分的多种生物学效应(调理作用和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用)则几乎全部丧失。

Wacker等人解决了在大肠杆菌中蛋白进行糖基化的问题,他证明空肠弯曲杆菌中发现的N-连接的糖基化途径可以移植到大肠杆菌。最近,也有科学家成功地把空肠弯曲杆菌中完整的有功能的糖基化操纵子移植到大肠杆菌中。尽管细菌和真核细胞的糖基化修饰结构有所不同,但这提高了在大肠杆菌中表达糖基化抗体或抗体片段的可能性。

作为一种创新的方法,令人兴奋的是,我们不应该低估将完整的糖基化途径转移到原核宿主中的困难以及将大的复杂分子表达到革兰氏阴性细菌的周质中的限制。 尽管如此,代谢工程和基因组重建等技术将暂时将大肠杆菌或其他细菌宿主定位为经济可行的糖蛋白生产的候选宿主。

1.2其他原核系统

抗体片段已经在很多细菌宿主中被表达,如枯草芽孢杆菌,乳酸菌,变青链霉菌,肉膜葡萄球菌和恶臭假单胞菌。尽管非常具有创新性,无论是宿主方面还是载体设计方面,至今没有显著证据表明这些宿主会替代大肠杆菌,除了恶臭假单胞菌之外。

由于在细菌中全长抗体的装配和糖基化依然存在问题,所以哺乳动物细胞或转基因物种目前更适于生产这些分子。

2.昆虫细胞和杆状病毒表达系统

杆状病毒表达系统已经成功的用于表达有活性的抗体或者抗体片段。具有人Fc区的即用型盒式杆状病毒载体已被改造用于表达全抗体,其中可变区在来自于噬菌体库筛选。由于其内在的性质,杆状病毒表达系统还是比较难适合大规模复杂多元分子的制备。

3.酵母和丝状真菌

在没有动物来源组分和化学成分确定的培养基中,酵母能分泌大量重组蛋白。这一特点使得酵母可以用来表达那些在大肠杆菌中不能表达为有功能的蛋白,它能很好的解决折叠和糖基化等问题。

好几个抗体片段,比如scFvFab被报道在毕赤酵母中获得了高表达量。毕赤酵母的遗传操作和大肠杆菌一样容易,重要的是拥有真核蛋白翻译途径。毕赤酵母对糖蛋白过度糖基化修饰而形成不同与人的高甘露糖链的缺陷会影响抗体的免疫原性和Fc介导的生物学效应。为了解决这个问题,科学家们已经实现对毕赤酵母的蛋白糖基化修饰途径基因工程改造,构建的新型糖工程毕赤酵母表达系统(Glycoengineered Pichia Pastoris)能够生产出具有与人体相适的蛋白糖链。Zhang 等人报道了,在临床试验中,糖工程毕赤酵母生产的Her2抗体完全可以与曲妥珠单抗相媲美。丝状真菌如泡盛曲霉、黑曲霉、里氏木霉也被用于表达抗体片段和全长IgG

4.转基因植物

从植物中提取的抗体,即所谓的植物抗体理论上具有生产成本上的优势,且易于放大。并且,它们不可能含有动物来源的病原体,如朊病毒和动物病毒。1989年,第一个功能性的单抗在植物中得到了表达。从那时起,植物抗体在转基因烟草、大豆、苜蓿和其他植物中得到了成功制备。植物已经被证明是生产治疗性单抗的有效系统。迄今为止,植物是唯一一个大规模、商业上可行的用于生产分泌IgA的表达系统。大量分泌型IgA抗体的成功制备为粘膜免疫系统疾病开辟了许多新的治疗机会。 在一项人体试验中,植物来源的重组sIgA阻止了变形链球菌在口腔中的定植。

当然,植物表达系统也是有不少缺点的:比如说建立和筛选转基因植物的时间较长;另外一个就是人们对转基因植物的接受度不高。对这些问题的一个暂时解决办法是瞬时表达,比如农杆菌侵染介导的基因瞬时表达技术,这种情况下,是不会得到转基因植物的(宿主植物基因不修饰),而且从载体设计到大规模制备的时间跨度很小。

另外,科学家还要解决植物抗体的均一性,及免疫原性。这些可以通过靶基因的替换来解决。比如在小立碗藓,这种植物的一个优势是很容易做靶基因替换操作。通过这种方式,科学家就创造了一种具有无免疫原性的同时人源化的糖修饰模式的小立碗藓。在良好的生产条件下实施大规模生产和下游加工依然仍然具有挑战性。

5.转基因动物(略)

6.无细胞翻译,体外表达系统(略)

7.糖基化模式和表达系统(略)

Souce: 纽普生物    2018-03-18