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X射线晶体学之常见问题

1. 蛋白质修饰如糖基化会不会影响蛋白结晶?

在蛋白结晶过程中,糖基化一般被认为会影响蛋白的均一性和表面熵,从而阻碍蛋白结晶。但是也有实验表明糖基化不会影响蛋白质结晶(10.1021/cg7006843),应该无差别对待。如果糖基化蛋白不能形成晶体,那么就应该尝试将糖链给去掉。有好几种方法可以去掉糖侧链:1)先用PNGase去掉所有的N-连接的糖;2)然后再用内切糖苷酶,如Endo F1, F3, Endo H这些进行消化,它们会在Asn残基上留下一个GlcNAc;3)如果内切糖苷酶不起作用,那么再试试用外切糖苷酶,如唾液酸酶,半乳糖苷酶,己糖胺酶和甘露糖苷酶这些。

2. 蛋白质变性/复性会不会影响蛋白结晶?

没有证据表明包涵体蛋白通过变复性之后会增加蛋白结晶的难度。唯一的挑战是蛋白的复性过程,特别是针对膜蛋白,期间可能要尝试多种去垢剂(价格昂贵)。复性后得到的可溶蛋白需要满足以下几个条件,才有可能长出晶体:

  1. 蛋白的均一性要好(化学均一性、构象均一性),这个可以通过动态光散射进行测定(DLS)

  2. 溶解性要好,蛋白浓度尽量高(8-30mg/ml)

3. 大的融合标签(如MBP,GST,TRX)会不会影响蛋白结晶和结构?

常用的几种蛋白融合标签如MBP,GST,TRX常常用来提高蛋白表达量,提高蛋白可溶性,防止蛋白降解,促进蛋白折叠及便于蛋白亲和纯化。但是这些标签的引入常常会导致蛋白不均一,从而阻碍晶体形成。但是也有文献表明,这些融合标签的存在会促进晶体形成。所以通常情况下,会把融合标签去掉;如果去掉之后不能形成结晶,可以尝试带上融合标签。至于融合标签会不会影响蛋白结构,这个因蛋白/标签不同而异。最简单的方式是对融合蛋白进行功能/活性测定,如果功能和活性保留,那么可以认为融合标签对结构的影响不是十分显著,毕竟我们研究蛋白结构的目的主要还是为了从结构上解释功能。

Souce: 纽普生物    2017-12-29